洋葱N/S型细胞质分子标记开发及orf725功能初探

摘要

洋葱(Allium cepa L.)是一种百合科葱属二年生草本植物，可鲜食、可加工，营养丰富，且具有一定的药用价值，有着“蔬菜皇后”的美誉。洋葱花器官较小，很难用人工控制的方法生产杂交种，因此雄性不育系及保持系的选育对于杂交种的生产尤为重要。本研究根据已知的洋葱细胞质雄性不育候选基因orf725，开发了区分洋葱S型与N型细胞质的分子标记，在此基础上通过农杆菌介导的遗传转化方法，对洋葱细胞质雄性不育候选基因orf725的功能进行了初步分析。主要结果如下:
　　1.开发了鉴定洋葱细胞质基因型的SCAR标记，命名为OC2175。该标记在洋葱不育系中扩增出两条带（2175bp和1053bp），而保持系中仅扩增出1053bp的条带。利用17组不同遗传背景的不育系及其相应的保持系进行验证，该SCAR标记的鉴定结果与田间表型判断结果完全吻合。
　　2.以pET32a为基础载体，利用clontech的In-Fusion HD Cloning技术成功构建了orf725的原核表达载体pET32a-orf725。转化大肠杆菌E.coil BL21(DE3)，获得了带有重组质粒的工程菌，通过IPTG诱导外源蛋白表达。结果表明orf725表达蛋白对宿主细胞的生长有明显的抑制作用，生长曲线显著低于对照。可能是因为ORF725作为COXⅠ类似物的竞争性抑制剂消耗了COXⅠ类似物的耦合位点，从而影响能量产生，导致产能不足进而影响了细胞的生长;也可能是因为orf725编码一种细胞毒素肽，对大肠杆菌具有一定的致死作用。
　　3.根据GenBank公布的水稻恢复基因Rf1b序列，克隆获得了Rf1b恢复基因5'侧翼线粒体靶向肽序列。将Rf1b5'置于orf725之前构建了Rf1b5'-orf725嵌合基因，然后将该嵌合基因连入双元载体pTCK303的BamHⅠ和SacⅠ位点，成功的构建了靶向线粒体的orf725功能验证载体。
　　4.利用农杆菌介导的浸花法转化拟南芥，获得了潮霉素抗性植株。经PCR检测、GUS染色、表型检测以及花粉粒的亚历山大染色，成功的获得了转基因突变体植株，其表型为花器官变小，部分花粉粒失去活性，育性降低。其原因可能为ORF725的表达竞争性的抑制了正常COXⅠ的功能，进而影响了能量的代谢。本研究为进一步明确orf725的分子机制奠定了基础。

目录

声明

符号说明

摘要

1 前言

1．1 洋葱细胞质雄性不育研究进展

1．1．1 植物雄性不育的分类

1．1．2 洋葱雄性不育的类型

1．1．3 洋葱雄性不育在形态上的表现

1．2 洋葱雄性不育分子标记的研究

1．2．1 细胞核育性恢复基因位点标记的研究

1．2．2 细胞质不育基因标记的研究

1．3 育性恢复基因及洋葱细胞质雄性不育分子机理的研究

1．3．1 作物育性恢复基因的研究

1．3．2 洋葱细胞质雄性不育的分子机理

1．4 本研究的目的和意义

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．1．1 仪器设备

2．1．2 试验试剂

2．1．3 植物材料菌株质粒

2．2 试验方法

2．2．1 分子标记的开发与验证

2．2．2 洋葱CMS相关基因orf725的原核表达分析

2．2．3 orf725在拟南芥中的功能初探

3 结果与分析

3．1 洋葱细胞质雄性不育基因分子标记的开发

3．1．1 基因组总DNA的检测分析

3．1．2 洋葱细胞质雄性不育SCAR标记引物设计

3．1．3 PCR条件优化

3．1．4 SCAR标记在洋葱不育系及保持系中的验证

3．2 orf725原核表达分析

3．2．1 原核表达载体构建

3．2．2 外源蛋白的诱导表达生长曲线

3．3 洋葱细胞质雄性不育相关基因orf725在拟南芥中的功能初探

3．3．1 orf725基因双元载体构建及检测

3．3．2 转化用工程菌的验证

3．3．3 潮霉素筛选压力的确定

3．3．4 转基因植株的获得与验证

3．3．5 转基因植株的表型观察与鉴定

4 讨论

4．1 洋葱CMS基因分子标记开发与优化

4．2 洋葱orf725基因的表达对大肠杆菌生长的抑制作用

4．3 洋葱orf725基因在拟南芥中的功能初探

5 结论

参考文献

附录

致谢

攻读学位期间发表论文情况