洋葱S型细胞质雄性不育相关基因的克隆与功能研究

摘要

洋葱（Allium cepa L.）为百合科葱属，二年生异花授粉作物。其杂种优势明显，杂种一代一般能增产20%~50%。洋葱花器官小，单花结籽率低，生长周期长，因此利用常规育种方法选育杂交种耗时长、成本高。雄性不育材料的发现以及雄性不育系的成功选育为洋葱杂种优势的利用开辟了一条新的途径，分子标记技术的发展与应用更是大大缩短了育种年限。本研究对洋葱线粒体全基因组中的58个开放阅读框（ORF）进行差异表达分析，发现了一个表达差异片段orf393，并开发了一个可以快速准确鉴别洋葱S型和N型细胞质的SCAR标记，在此基础上通过农杆菌介导的遗传转化方法，对获得的洋葱表达差异片段orf393的功能进行了初步研究。主要研究结果如下： 1. 以洋葱S型细胞质雄性不育系和保持系为试材，对58个ORF进行差异表达分析，发现了一个表达差异片段orf393，其在雄性不育系中表达而在保持系中不表达。测序后比对发现，与雄性不育系相比，保持系中的orf393有一段36个碱基的缺失，同时产生了29个SNP，且第11个SNP造成了CAG变为TAG，导致翻译提前终止。 2. 根据orf393在洋葱S型细胞质雄性不育系和保持系DNA序列上的差异，开发出一个可以鉴定洋葱细胞质类型的SCAR标记，命名为GXX393。该标记在S型细胞质雄性不育系中扩增出232 bp大小的特异条带，在保持系中扩增出196 bp大小的特异条带。利用不同遗传背景的已知细胞质类型的10个组合材料进行验证，PCR扩增结果与田间表型完全吻合。该标记通过一次简单PCR即可快速准确地区分洋葱S型和N型细胞质。 3. 根据orf393的序列设计了特异性定量PCR引物，采用实时荧光定量PCR技术，利用洋葱S型细胞质雄性不育系和保持系的根，叶片，花茎以及花粉母细胞、四分体、单核花粉粒、成熟花粉粒等4个发育时期的花蕾对orf393进行时空表达分析。结果表明：orf393在S型细胞质雄性不育系的根、叶片、花茎和4个发育时期的花蕾中均有表达，尤其是在四分体时期表达量最高，之后恢复到营养生长时期的表达水平，但在保持系中未见其表达。这表明orf393是组成型表达，可能与不育系花粉的败育存在某种关联。 4. 利用In-Fusion Cloning的方法，成功构建了含有线粒体靶向信号的orf393功能验证载体pROK2-Rf1b-orf393，并通过农杆菌介导的浸花法转化拟南芥，获得了卡那抗性植株。通过表型鉴定、PCR检测、花粉粒的亚历山大染色及解剖观察，成功地获得了转基因植株。与野生型植株相比，转基因植株雌蕊柱头表面光滑没有花粉附着，雄蕊短，花药颜色暗淡不开裂且仅含有少量有活性的花粉粒，果荚短小萎缩、几乎不含种子。这表明转基因植株不能正常散粉、育性下降，说明orf393可能是洋葱细胞质雄性不育的重要相关基因。

目录

声明

符号说明

1前言

1.1植物雄性不育

1.2洋葱细胞质雄性不育的研究进展

1.3分子标记辅助选择技术的应用

1.4研究的目的与意义

2材料与方法

2.1试验材料

2.2试验方法

3结果与分析

3.1洋葱细胞质雄性不育候选基因的挖掘

3.2 orf393在洋葱S型细胞质雄性不育系和保持系中的DNA序列分析

3.3细胞质雄性不育相关基因orf393的应用

3.4 orf393在洋葱S型细胞质雄性不育系和保持系中的时空表达分析

3.5 orf393在拟南芥中的功能初探

4讨论

4.1洋葱CMS与线粒体基因的关系

4.2洋葱CMS分子标记的开发

4.3洋葱CMS花粉败育时期与特征

4.4洋葱orf393基因在拟南芥中的功能初探

5结论

参考文献

附录

致谢

攻读学位期间发表论文情况