甘蓝型油菜nap细胞质雄性不育恢复基因Rfn的克隆及其应用

摘要

本发明提供了一种甘蓝型油菜细胞质雄性不育恢复基因的分离克隆、功能验证和应用。本发明分离的甘蓝型油菜nap细胞质雄性不育恢复基因Rfn，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，它编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。该基因属于PPR基因家族的成员，为一个组成型表达的基因。将Rfn转化导入不含有nap细胞质恢复基因的油菜，可以获得育性恢复的植株。恢复基因Rfn的克隆及验证可用于甘蓝型油菜优良自交系和常规品种选育，解决部分材料在低温条件下花粉不足、产量下降的现象。

说明书

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种甘蓝型油菜nap细胞质雄性不育恢复基因及其应用。

背景技术

植物雄性生殖器官不能产生正常的雄配子即花粉的现象称为雄性不育，具有雄性不育特性的植物或作物品系称为不育系。而一些品系与不育系杂交能够产生具有正常育性的植株，这些植物或作物品系称为恢复系。利用不育系作母本和恢复系作父本杂交进行杂交，可配制高纯度的杂交种。因此，不育系和恢复系在作物杂交育种中具有重要价值。

对于雄性不育及其育性恢复的研究在多种农作物如水稻、小麦、玉米、大豆、油菜等已有报道，在生产上已广泛应用于杂交种生产。雄性不育的遗传基础包括核基因控制的细胞核雄性不育(Genic male sterility,简称GMS)和细胞质控制的细胞质雄性不育(Cytoplasmic male sterility,简称CMS)。利用CMS及其育性恢复特性进行杂交育种的方法通常称为“三系法”，即不育系、恢复系和保持系。其中不育系具有线粒体基因组中特异基因控制的细胞质雄性不育特性。恢复系具有正常的细胞质或不育的细胞质，花粉正常可育，自交可结实，其特点是核基因组中携带育性恢复基因(fertility restorer gene，简称Rf)。保持系具有正常的细胞质，花粉正常可育，但其核基因组中不携带有功能的恢复基因。

甘蓝型油菜细胞质雄性不育有多种类型，如同源胞质类型nap CMS和pol CMS；异源胞质类型有ogu CMS，tour CMS，hau CMS等。pol CMS、ogu CMS及tour CMS在国内外油菜杂交育种中有较广泛的应用。由于大部分甘蓝型油菜栽培品种中均含有nap CMS的恢复基因而表现为可育。只有少数品种由于缺少恢复基因Rfn而表现为不育或部分不育，同时napCMS不育植株在相对较高的温度情况下就会变为部分可育或完全可育(Fan和Stefan,1986)，限制了该系统在油菜杂交种生产上的应用。然而在甘蓝型油菜自交系或常规品种选育过程中，经常有品种出现分段结实的现象。具体表现为：低温条件下，有效花序段部分花蕾在尚未开放时即黄化脱落，或能正常开花但不能正常发育结实，有的花即使能发育成角果，但每个角果仅有少量种子，而在温度较高的情况下则结实完全正常。这必将导致无效角果增加，产量下降。

发明内容

本发明的目的在于提供一个甘蓝型油菜细胞质雄性不育恢复基因Rfn，利用该基因可恢复甘蓝型油菜nap CMS的育性，或作为分子标记，促进甘蓝型油菜优良自交系和常规品种选育。

为了实现本发明的目的，发明人通过大量试验研究并不懈努力，最终从甘蓝型油菜中分离得到一种甘蓝型油菜nap CMS的恢复基因Rfn，其核苷酸序列如序列表中SEQ IDNO:1所示。

根据本领域的常规技术手段，本发明人可以采用已克隆的多核苷酸序列作为探针，从基因组或cDNA文库中筛选得到本发明的基因或同源基因。同样，采用PCR技术也可以从基因组和cNDA中扩增得到本发明的基因或任何一段感兴趣的核苷酸序列或与其同源的核苷酸序列。因此，在严格条件下与序列表中SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列杂交且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列也属于甘蓝型油菜nap CMS的恢复基因序列。

进一步地，上述任意一种核苷酸序列经核苷酸添加、删除、替换、修饰的保守性突变而获得的保守性变异体也属于甘蓝型油菜nap CMS的恢复基因序列。

另外，本发明还提供了一种表达甘蓝型油菜细胞质雄性不育恢复基因Rfn的蛋白，其氨基酸序列由上述任意一种核苷酸序列编码。进一步优选地，所述表达甘蓝型油菜细胞质雄性不育恢复基因Rfn的蛋白，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。

再者，本发明还提供了一种上述甘蓝型油菜细胞质雄性不育恢复基因Rfn的等位基因，其核苷酸序列选自以下的任意一种：

(1)序列表中SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；

(2)在严格条件下与(1)限定的核苷酸序列杂交且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列；

(3)与(1)或(2)限定的核苷酸序列经核苷酸添加、删除、替换、修饰的保守性突变而获得的保守性变异体。

最后，本发明还提供了上述的甘蓝型油菜细胞质雄性不育恢复基因Rfn在甘蓝型油菜遗传改良中的应用。以及，上述的甘蓝型油菜细胞质雄性不育恢复基因Rfn的等位基因在甘蓝型油菜遗传改良中的应用。

与现有技术相比，本发明首先提供了一种甘蓝型油菜nap CMS的恢复基因Rfn，该基因属于PPR基因家族的成员，为一个组成型表达的基因。将Rfn转化导入不含有nap细胞质恢复基因的油菜，可以获得育性恢复的植株。恢复基因Rfn的克隆及验证可用于甘蓝型油菜优良自交系和常规品种选育，解决部分材料在低温条件下花粉不足、产量下降的现象。另外，以甘蓝型油菜恢复基因Rfn序列本身或附近的序列产生的紧密连锁的分子标记，可用于甘蓝型油菜自交系和常规品种分子标记辅助选择育种。

附图说明

图1为甘蓝型油菜nap细胞质雄性不育系及其恢复系不同温度条件下的形态。

图2为甘蓝型油菜nap细胞质雄性不育系恢复基因Rfn位点的局部遗传连锁图。

图3为甘蓝型油菜nap细胞质雄性不育系恢复基因Rfn位点的精细遗传连锁图。

图4为覆盖甘蓝型油菜nap细胞质雄性不育恢复基因Rfn区段的物理图谱。

图5为甘蓝型油菜功能互补测验表达载体pFGC-Rfn载体示意图。

图6为具有181A遗传背景的T₀代遗传转化甘蓝型油菜植株开花后育性表型与181A表型的比较。181A遗传转化T₀代植株携带显性基因Rfn的候选基因，表现为花丝伸长，育性恢复，花粉粒醋酸洋红染色正常。

图7为转基因阳性单株自交后代株系PCR鉴定及育性共分离分析。F为可育株，S为不育株，N为阴性对照，P为阳性质粒对照，M为DL2000分子量标准。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明做进一步说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明的保护范围以权利要求书为准，不受下面公开的具体实施的限制。下述所使用的实验方法若无特殊说明，均为本技术领域现有的常规方法和技术，所使用的试剂配方或材料，均通过商业途径得到。

实施例1甘蓝型油菜nap细胞质雄性不育系及其恢复系的发现及遗传分析

发明人在甘蓝型油菜育种过程中发现，含有nap细胞质的优良自交系181-1在相对低温时花瓣皱缩，雄蕊发育不正常，而在温度相对较高的条件下雄蕊发育基本恢复正常(图1)。通过大量测交发现，优良自交系H5能够在低温条件下专一恢复181-1至正常雄蕊表型，H5与pol不育系1141A、245A、7492A杂交后代均保持不育。H5与181-1杂交F₁与181-1回交获得的BC₁带在低温条件下可育和不育表现为1:1的分离比，F₁自交后代在低温条件下可育和不育表现为3:1的分离比(表1)。后续将181-1命名为181A。

表1甘蓝型油菜nap细胞质雄性不育恢复基因的遗传分析

*χ²(0.05,1)＝3.84

实施例2甘蓝型油菜nap细胞质雄性不育恢复基因的精细定位

1.实验材料：

本实验用于甘蓝型油菜nap细胞质雄性不育恢复基因的精细定位的亲本材料为181A和H5。由181A与H5杂交获得F₁植株，将F₁植株自交获得F₂群体，于2012年秋季播种于武汉，2013年春天提取225个不育单株的DNA(提取DNA的方法参见：Stewart>1与181A回交构建BC₁群体，于2013年秋季播种于武汉，2014年春天提取5,652个BC₁单株的DNA，用于基因的精细定位。

2.恢复基因Rfn的精细定位：

根据前人研究结果，甘蓝型油菜nap细胞质雄性不育恢复基因Rfn与pol细胞质雄性不育恢复基因Rfp可能为同一核基因位点的不同等位基因和单倍型(Li et al.,1998)。申请人利用在pol CMS恢复基因定位过程中的引物筛选与Rfn连锁的分子标记，发现6个与Rfn紧密连锁的分子标记。

6个与Rfn紧密连锁的分子标记的序列如下表所示：

BrIP24F：ATCAGTCCCTCTGATCGGCT

BrIP24R：GCGACCTGAAGTTGGACGA

BrIP47F：GACGCACCTCAAGCCAAAG

BrIP47R：GGCTACGACATTCCCACCA

BrIP53F：CGTTTGGACAAGTTTTCACG

BrIP53R：CTTTGAACTATTGCCGGTGA

BrIP59F：GAATCTGGTGAAGGCAGTAAC

BrIP59R：TCTCCTCTTTCTTACCTGCTG

BrIP63F：TGGGATGCTCTGTTTCTGAC

BrIP63R：GATCTAGCCGAGTGTAAGCG

BrSC39F：TAATGCGAATTTTCAGGGGT

BrSC39R：ATGGACCAGGCTTTACTTCC

申请人根据以上6个标记在F₂群体不育株基因型检测结果，根据各标记检测出的交换单株数目，计算标记与Rfn位点之间的重组率，并利用Kosambi函数(Kosambi,1944)计算遗传距离，绘制如图2所示的局部连锁图谱。发现这些标记均位于Rfn位点的一侧。

为获得另一侧与Rfn基因连锁的标记，申请人根据目标区域的序列(以公布的白菜基因组序列为参考)设计并鉴定出Rfn连锁的多态性标记。分子标记BrIP47和BnSR21在BC₁群体中分别检测到79个和25个交换单株，这些单株中两个标记和Rfn之间发生了重组(图4)。然后用其余的标记对交换单株进行分析，发现两侧最近的标记是BnSR33和BrIP77，两个标记分别有4个和2个单株在标记与Rfn间表现交换(图3)。通过以上精细定位，将Rfn基因定位中甘蓝型油菜参考基因组约10.5kb的范围内。用于精细定位Rfn的引物的核苷酸序列如表2所示。

表2.精细定位Rfn基因的引物的核苷酸序列

实施例3恢复基因Rfn候选基因的分离、转化及功能验证

1.恢复基因Rfn候选基因的确定

本实施例中采用的序列比对的程序来自白菜基因组网站提供的Blast(http://brassicadb.org/brad/blastPage.php)软件，对候选区段10.5kb的序列进行分析，从中预测一个编码PPR蛋白的候选基因ORF2。根据参考基因组序列，开发相应引物并扩增出目标基因ORF2的基因组序列。对ORF2基因序列进行酶切位点分析，发现其不含有EcoR I和BamH I酶切位点。设计扩增基因全长的引物ORF2F(R)，左右引物分别加上EcoR I和BamH I的酶切位点，利用高保真PCR聚合酶(Phusion High-Fidetity DNA Potymerse，来自New EnglandBiolabs公司)扩增获得一个5,620bp的片段。

ORF2F(正向引物)：CGgaattcGTCCAACCACAATGGCTTTAAC

ORF2R(反向引物)：CGggatccATTGCTAAGGCGAATCCGGTTG

扩增片段包含基因上游非翻译区2,019bp的序列、基因区间1,890bp的序列和下游非翻译区1,711bp的序列。扩增片段用胶回收试剂盒(购自Promega公司)回收，用EcoR I和BamH I双酶切后回收目标片段，连接到经EcoR I和BamH I双酶切的表达载体pFGC5941上(图5)，连接产物转化大肠杆菌菌株DH5α，在含有50ug/ml卡那霉素的LB培养基上筛选转化子，挑选单菌落提取质粒，并用通过测序检测确定核昔酸序列完全正确，成功构建了转化植株的载体(图5)。正确的融合质粒pFGC-Rfn通过电转化的方法转入GV3101农杆菌菌株中(本实验室长期保存的菌株)，在含有50μg/ml卡那霉素和50μg/ml庆大霉素的固体培养基上挑取单克隆，并进行PCR检测确认阳性克隆后，将该单克隆于-80℃保存起来，用于甘蓝型油菜的遗传转化。

油菜遗传转化采用常规的农杆菌转化法(陈苇等，2006；Cardoza and Stewart,2003)。种子灭菌70％的酒精浸泡种子15min，0.1％升汞消毒15min，无菌水清洗3次，每次间隔5min。将灭菌的种子播于Medium 0培养基(配方见表3)，于25℃暗培养5d。在超净工作台内将幼苗的下胚轴切成0.5-0.8cm的小段，在含有农杆菌(悬浮过夜至对数生长期)的Dilution Medium上(配方见表3)浸染25-30min后，吸干液体，于25℃黑暗条件下共培养2d。将外植体转移到愈伤组织诱导培养基Medium 1(配方见表3)上，于25℃光照培养7-10d。再将外植体转入分化培养基Medium 2上培养，每2-3周继代1次，直至分化出芽。将分化出的芽下端切断插入到筛选培养基Medium3上筛选2周，再将存活的芽转移至生根培养基Medium 4上培养至生根后，种植于混有腐殖土的营养钵中，保持70％相对湿度，待根发育稳定后移栽到大田。

提取抗性植株叶片总DNA(制备方法见：Stewart et al.,1993)，用引物Rfn-F和Rfn-R通过PCR进一步鉴定转化植株。转基因T₀代观察育性的表现，验证导入的候选基因的功能。结果显示在19株转基因T₀代植株中，有9株表现为花丝伸长，育性恢复(图6)。将T₀代植株自交后代播于大田中，开花后调查植株育性，并提取叶片总DNA(Stewart>

Rfn-F：GTTCTTGCTGTAAAGCGTTGT

Rfn-R：GTTGCGTTTTCATTGCTTGTC

表3在遗传转化步骤中所用的各种培养基配方

SEQUENCE LISTING

<110>华中农业大学；武汉联农种业科技有限责任公司

<120>甘蓝型油菜nap细胞质雄性不育恢复基因Rfn的克隆及其应用

<160>3

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>1890

<212>DNA

<213>甘蓝型油菜（Brassica napus）

<400>1

atgttgtgtc ggagattggt gcttgtgtct cgtatccccc tgagtcctgt tggtactctt60

gcaactcctt tgctctcttt tatcagatcc tcatgcgaac gaggctactc tggtctcggc 120

agcgatagaa atctctcatc ttacaaagag agactgagaa gtggtctggt cgatatcaag 180

aagaaggatg ctgtagctct gtttcagtcc atgattaggt ctcgtcctct tcctacggtc 240

atggatttca ataaactgtt tagtgcagta gccagaacga aacagtatga tctcgtgttg 300

gatctctgca agcaaatgga actgcaaggg attgcacata gcatttacac gctgagtatt 360

atgatcaatt gcttctgccg cctccagaaa ctcggttttg ctttttctgt gatgggaaag 420

atgttgaagc ttgggtatga gcccgacaca atcacattct caactttgat caacggttta 480

tgtctggtgg gtagagtttc caaagctgtg gagttagttg atcatatggt agatatgaag 540

gttattccaa atctcatcat acttaacact attgtcaatg ggctttgtct ccaagataga 600

ctctctgaag caatgtcttt gatacatcga atgttggcta atgggtgcca acccgacgca 660

gttacatatg gtccggtttt gaacagaatg tgtaagtcag ggaacactgc ctcggccttg 720

gatctcctcg gaaagatgga acttagaaag atcaagcctc aagtagtcac atacaatatc 780

atcattgaca gtctttgcaa ggatgggagc ctcgaagatg cactctgcct tttcaatgaa 840

atggaaacca aaggaatcaa agcaaatgtc attacctaca cctctctcat aggaggcttt 900

tgtagtgccg gaagatggga tgatggtgca cagttgctga gggatatgat tacaagggga 960

gtcaccccta acgttgtcac tttcaatgct ttgattgata gttttgtgaa agaaggacag1020

cttaccgagg ctaaaaaatt gtacaatgag atgatcacaa gaggcacaga tccaaatatc1080

attacatata actctttgat atatgggatg tgcatggaca actgcctaga tgaggccaac1140

cagatgctgg atatgatggt tagcaaggga ttctatcctg atattgtgac gtttaatatc1200

cttatcaacg gatactgtaa ggctaaacag gtcgatgaag gtacgagact tttccgcaat1260

atgtgtttaa gaggagtggt tgctgataca gtcacttata acactctcat ccaagggttt1320

tgtcaatcgg gaaaacttaa tgttgccaaa gaactcttcc aggagatggt ctttgttggt1380

gtgccaccca gtgttgtgac ttatagtatt ttgctggatg ggttgtgtga caatggggaa1440

ctagaaaagg ctttggaaat acttgatcaa atgctcaaga gtaagatgga acttgacatt1500

ggtatatata gtatcatcat tcacgggatg tgcaatgcta gtaagatcga tgatgcttgg1560

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atgattggag gattatgtaa gaaaggctcg ctgcctgaag cggtcttgtt gtttagaaag1680

atgggagagg ctggggttgc gccaagcagt ggtacataca acacactaat acgagctcat1740

ctcagaggtg gtgacttaac aaaatcagct gaacttatcg aagaaatgaa gaggtgtggg1800

ttctctgcag atgcttcaac cataaagatt gttatggata tgttattgga tggtagaatg1860

aagaaaagct ttctggatat gctttcttag 1890

<210>2

<211>629

<212>PRT

<213>甘蓝型油菜（Brassica napus）

<400>2

Met Leu Cys Arg Arg Leu Val Leu Val Ser Arg Ile Pro Leu Ser Pro

1 5 1015

Val Gly Thr Leu Ala Thr Pro Leu Leu Ser Phe Ile Arg Ser Ser Cys

202530

Glu Arg Gly Tyr Ser Gly Leu Gly Ser Asp Arg Asn Leu Ser Ser Tyr

354045

Lys Glu Arg Leu Arg Ser Gly Leu Val Asp Ile Lys Lys Lys Asp Ala

505560

Val Ala Leu Phe Gln Ser Met Ile Arg Ser Arg Pro Leu Pro Thr Val

65707580

Met Asp Phe Asn Lys Leu Phe Ser Ala Val Ala Arg Thr Lys Gln Tyr

859095

Asp Leu Val Leu Asp Leu Cys Lys Gln Met Glu Leu Gln Gly Ile Ala

100 105 110

His Ser Ile Tyr Thr Leu Ser Ile Met Ile Asn Cys Phe Cys Arg Leu

115 120 125

Gln Lys Leu Gly Phe Ala Phe Ser Val Met Gly Lys Met Leu Lys Leu

130 135 140

Gly Tyr Glu Pro Asp Thr Ile Thr Phe Ser Thr Leu Ile Asn Gly Leu

145 150 155 160

Cys Leu Val Gly Arg Val Ser Lys Ala Val Glu Leu Val Asp His Met

165 170 175

Val Asp Met Lys Val Ile Pro Asn Leu Ile Ile Leu Asn Thr Ile Val

180 185 190

Asn Gly Leu Cys Leu Gln Asp Arg Leu Ser Glu Ala Met Ser Leu Ile

195 200 205

His Arg Met Leu Ala Asn Gly Cys Gln Pro Asp Ala Val Thr Tyr Gly

210 215 220

Pro Val Leu Asn Arg Met Cys Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Ala Leu

225 230 235 240

Asp Leu Leu Gly Lys Met Glu Leu Arg Lys Ile Lys Pro Gln Val Val

245 250 255

Thr Tyr Asn Ile Ile Ile Asp Ser Leu Cys Lys Asp Gly Ser Leu Glu

260 265 270

Asp Ala Leu Cys Leu Phe Asn Glu Met Glu Thr Lys Gly Ile Lys Ala

275 280 285

Asn Val Ile Thr Tyr Thr Ser Leu Ile Gly Gly Phe Cys Ser Ala Gly

290 295 300

Arg Trp Asp Asp Gly Ala Gln Leu Leu Arg Asp Met Ile Thr Arg Gly

305 310 315 320

Val Thr Pro Asn Val Val Thr Phe Asn Ala Leu Ile Asp Ser Phe Val

325 330 335

Lys Glu Gly Gln Leu Thr Glu Ala Lys Lys Leu Tyr Asn Glu Met Ile

340 345 350

Thr Arg Gly Thr Asp Pro Asn Ile Ile Thr Tyr Asn Ser Leu Ile Tyr

355 360 365

Gly Met Cys Met Asp Asn Cys Leu Asp Glu Ala Asn Gln Met Leu Asp

370 375 380

Met Met Val Ser Lys Gly Phe Tyr Pro Asp Ile Val Thr Phe Asn Ile

385 390 395 400

Leu Ile Asn Gly Tyr Cys Lys Ala Lys Gln Val Asp Glu Gly Thr Arg

405 410 415

Leu Phe Arg Asn Met Cys Leu Arg Gly Val Val Ala Asp Thr Val Thr

420 425 430

Tyr Asn Thr Leu Ile Gln Gly Phe Cys Gln Ser Gly Lys Leu Asn Val

435 440 445

Ala Lys Glu Leu Phe Gln Glu Met Val Phe Val Gly Val Pro Pro Ser

450 455 460

Val Val Thr Tyr Ser Ile Leu Leu Asp Gly Leu Cys Asp Asn Gly Glu

465 470 475 480

Leu Glu Lys Ala Leu Glu Ile Leu Asp Gln Met Leu Lys Ser Lys Met

485 490 495

Glu Leu Asp Ile Gly Ile Tyr Ser Ile Ile Ile His Gly Met Cys Asn

500 505 510

Ala Ser Lys Ile Asp Asp Ala Trp Asp Leu Phe Cys Ser Leu Pro Leu

515 520 525

Lys Gly Val Lys Pro Glu Val Arg Thr Tyr Asn Ile Met Ile Gly Gly

530 535 540

Leu Cys Lys Lys Gly Ser Leu Pro Glu Ala Val Leu Leu Phe Arg Lys

545 550 555 560

Met Gly Glu Ala Gly Val Ala Pro Ser Ser Gly Thr Tyr Asn Thr Leu

565 570 575

Ile Arg Ala His Leu Arg Gly Gly Asp Leu Thr Lys Ser Ala Glu Leu

580 585 590

Ile Glu Glu Met Lys Arg Cys Gly Phe Ser Ala Asp Ala Ser Thr Ile

595 600 605

Lys Ile Val Met Asp Met Leu Leu Asp Gly Arg Met Lys Lys Ser Phe

610 615 620

Leu Asp Met Leu Ser

625

<210>3

<211>1890

<212>DNA

<213>甘蓝型油菜（Brassica napus）

<400>3

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agcgatagaa atctctcatc ttacaaagag agactgagaa gtggtctggt cgatatcaag 180

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