TGN/EE介导的囊泡运输与GDI1协同调控根毛中ROP2 GTPase的动态定位的机理研究

摘要

根毛是根表皮细胞凸起形成的管状结构，是植物吸收水分和无机盐的主要部位，其形态的维持对植物的生长发育及响应外界胁迫具有重要意义。由于根毛培养周期较短，便于细胞学观察，与病原菌存在互作关系，并且是快速生长的极性细胞，而成为优良的研究系统。在此我们以根毛为研究体系，探索小G蛋白ROPs(Rho-related GTPases fromplant)极性定位的调控机制。已有研究表明植物细胞极性生长的维持依赖于活性ROPs的时空特异性定位。ROPs是植物中一类重要的小G蛋白，在植物生长发育、激素信号转导、抗逆和抗病过程中起重要的调控作用。ROPs具有“分子开关”的作用，分为GTP结合的活性形式和GDP结合的非活性形式，调控其形式转变的作用因子分为三类，鸟苷酸交换因子(guanine nucleotide exchange factors，GEFs)、GTP酶活化蛋白(GTPaseactivating proteins，GAPs)和鸟苷酸解离抑制因子(guanine nucleotide dissociationinhibitors，GDIs)。其中GEF和GAP调控机理的研究相对清晰，GEF使非活性形式的ROPs转化为活性形式的ROPs，而GAP使活性形式的ROPs转化为非活性形式。目前关于GDI调控ROP的机制研究并不是很清晰，且主要集中于GDI从质膜上移除ROP进入胞质的负调控作用。然而，利用动物以及酵母系统进行的研究表明，GDI除了这种负调控外，还负责将Rho从内质网膜转运到质膜上，即对其定位具有正调控作用。植物中的GDI是否有类似的功能还不清楚。此外，动物及酵母Rho靶向质膜的途径除了GDI参与外，还通过特定的囊泡运输途径介导。这一方面在植物细胞系统中还尚未有报道。本研究旨在揭示GDI及囊泡运输对根毛中重要的小G蛋白ROP2动态定位的调控作用。研究结果和主要结论如下:
　　(1)根毛中GDI1调控ROP2的顶端质膜定位
　　GDI1功能缺失突变体scn1-1根毛中ROP2的顶端极性定位发生紊乱，造成根毛的多个起始。我们利用CITRINE-TUBBY-C标记scn1-1突变体中phosphatidyl inositol4，5-bisphosphate(PIP2)的定位，结果发现在scn1-1突变体根毛中确实存在多个PIP2聚集的生长点，并且PIP2在根毛顶端的分布范围扩大，暗示GDI1功能丧失干扰了单一顶端的形成和维持。为了研究GDI1是否介导ROP2靶向质膜的过程，我们通过荧光漂白恢复实验（fluorescence recovery after photobleaching，FRAP）对野生型和scn1-1突变体根毛顶端质膜上GFP-ROP的定位进行研究，在野生型根毛顶端质膜上的GFP-ROP被漂白后能够快速恢复，在scn1-1突变体中GFP-ROP的恢复速度明显慢于野生型。说明GDI1对于ROP2靶向质膜的过程具有关键作用。
　　(2)反式高尔基网络（TGN/EE，trans-Golgi network/early endosomes）介导的囊泡运输参与调控ROP2的动态定位。
　　为了探究ROP在根毛顶端质膜的极性定位是否还依赖于囊泡运输途径的调控，我们结合遗传学和药剂学的手段，阻断特定的囊泡运输途径，分析ROP的动态定位。我们的结果表明ROP2的动态定位依赖于ARF1(ADP-ribosylation factor1)，布雷菲德菌素A(brefeldin A，BFA)敏感的高尔基后囊泡运输途径。高尔基后囊泡运输途径又分为两条，包括衔接蛋白AP1(Adaptin Protein1)介导的在TGN/EE上进行的外排途径和RabA4b介导的外排途径。我们进一步的研究结果表明AP1介导的TGN/EE上的外排途径参与ROP靶向质膜的过程。并且ROP2的动态定位不依赖于RAB5调控的液泡降解途径。
　　(3) FRAP实验表明GDI1和囊泡运输共同调控ROP2顶端质膜的动态定位
　　我们利用BFA处理及ARF1-DN(dominant-negative)干扰外排运输途径，发现在根毛顶端质膜定位的GFP-ROP2漂白后恢复速度与野生型的恢复速度没有明显区别。但是将ARF1-DN通过杂交引入到scn1-1突变体或用BFA处理scn1-1突变体，与scn1-1突变体相比GFP-ROP2漂白后的恢复速度显著降低了，暗示GDI1对ROP2的顶端质膜定位具有关键的调控作用，而囊泡运输同样参与调控ROP2的动态定位。
　　结论:GDI1和囊泡运输协调控制根毛的极性生长。
　　我们发现GDI1对ROP2在根毛极性生长过程中的动态定位具有快速调控的作用，且控制根毛单一极性生长点的建立与维持。而囊泡运输途径受到GDI1途径的影响，主要在根毛的快速生长中起调控作用。这些结果证明GDI1与TGN/EE介导的囊泡运输这两条途径决定了ROP在根毛极性生长过程中动态的顶端定位，以保证根毛的极性建立、极性维持和快速生长。

目录

声明

符号说明

摘要

1 前言

1．1 根毛是快速生长的极性细胞

1．1．1 根毛的起始过程

1．1．2 根毛的极性生长

1．2 ROP的研究现状

1．2．1 ROP的分类

1．2．2 ROP的调控机理

1．2．3 ROS参与根毛的极性生长

1．3 囊泡运输的功能

1．3．1 TGN／EE囊泡分选中心

1．3．2 RAB介导的囊泡运输途径

1．3．3 ARF介导的囊泡运输途径

1．4 RhoGTPases极性定位的研究进展

1．5 荧光漂白恢复技术简介

1．6 本研究的目的及意义

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 植物材料及生长条件

2．1．2 菌株和质粒

2．1．3 酶与各种生化试剂

2．2 方法

2．2．1 构建转基因植物的表达载体

2．2．2 农杆菌介导的拟南芥遗传转化及突变体的鉴定

2．2．3 突变体基因组水平及转录水平鉴定

2．2．4 药剂处理及荧光染料染色

2．2．5 激光共聚焦显微镜观察及图像处理

3 结果与分析

3．1 GDI1在根毛起始与生长中的作用

3．1．1 GDI1调控ROP2在根毛顶端质膜的动态定位

3．1．2 GDI1保证根毛维持一个极性生长点

3．2 囊泡运输对ROP2顶端定位的调控作用

3．2．1 药剂学的方法干扰囊泡运输途径

3．2．2 利用遗传手段阻断相关囊泡运输途径

3．3 GDI1与囊泡运输协同调控ROP2的极性定位

3．3．1 BFA敏感的囊泡运输调控ROP2的动态定位

3．3．2 GDI1与囊泡运输协同调控ROP2的极性定位

4 讨论

(1)GDI1通过调控ROP2定位影响根毛的极性生长

(2)囊泡运输调控ROP2的极性定位

(3)GDI1与囊泡运输协同调控ROP2的极性定位

5 结论

参考文献

致谢

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