拟南芥根毛ROP2信号通路调控因子的筛选及其作用机理研究

摘要

根毛在植物水分吸收、营养物质摄取及与外界环境相互作用的过程中发挥重要功能，也是研究真核细胞极性建立、维持以及形态发生的模式系统之一。因此，对根毛生长调控机制的研究具有重要的生物学意义。Rho-related GTPases from plants（ROP）是高等植物中特有的一类小G蛋白，其参与植物生长、发育、抗病和激素信号转导过程,并在极性生长的细胞中起关键作用。ROP被称为根毛生长过程中的“分子开关”，存在与GTP结合的“活化形式”及与GDP结合的“非活化形式”，活化形式的ROP通过下游Ca2+、细胞骨架、活性氧等细胞活动调控根毛的生长。过去的研究中发现了ROP的多个重要调控因子，如GEFs、GAPs、GDIs等，但其调控机制尚不完全清楚。本研究利用反向和正向遗传学方法，发现了根毛生长过程中影响ROP2定位、活性及稳定性的重要调控因子—异戊烯化修饰酶（PLURIPETALA，PLP）和光敏色素B（phytochrome B，phyB）。研究结果有助于深入理解ROP如何调控根毛的极性生长。主要结果和结论如下： （1）PLP正调控根毛生长 异戊烯化修饰是一类重要的蛋白翻译后脂类修饰，其通过硫酯键将C15的法尼基或C20的牻牛儿牻牛儿基连接到蛋白质C末端CAAX基序的半胱氨酸残基上。对拟南芥中编码异戊烯化修饰酶α亚基的基因PLP的表达分析发现，PLP在根毛起始及顶端生长阶段都有高量表达。通过对PLP的T-DNA插入突变体plp-3的表型分析，发现突变体与野生型相比根毛的长度和密度均显著降低。外源的PLP可以完全互补plp-3的表型。表明PLP促进根毛起始及生长。 （2）PLP正调控ROP2的质膜定位 我们将根毛特异性启动子ProE7驱动的GFP-ROP2引入到野生型及plp-3突变体中。通过细胞学实验和生化实验分析，发现与野生型相比较，plp-3中ROP2质膜定位显著降低，胞质定位增多，质膜与胞质的ROP2蛋白量比值降低。结果表明PLP参调控ROP2在根毛质膜上的定位。 （3）PLP正调控根毛中ROP的下游信号途径 ROP2在plp-3根毛中质膜定位减少，暗示ROP下游途径受到影响。为了提供进一步的证据，我们分析了ROP介导的微丝骨架动态组装、活性氧（ROS）的产生和囊泡的内吞外排过程。通过引入标记微丝骨架的ABD2-GFP，发现在plp-3突变体根毛起始处，顶端微丝的网状积累显著降低；plp-3突变体根毛生长过程中，微丝纵向充斥到根毛顶端，成束增加。对根毛中的ROS进行荧光染色，发现plp-3突变体根毛中ROS的水平明显降低。通过引入标记外排囊泡的YFP-RabA4b，发现plp-3突变体中外排囊泡的倒锥形结构区域明显缩小。利用亲脂性染料标记质膜内吞的囊泡活动时，发现plp-3突变体中内吞的囊泡也明显减少，没有明显的倒锥形结构。由此可见，PLP的功能缺失影响了ROP信号下游微丝骨架的动态组装、ROS的产生和囊泡内吞外排的过程。 （4）PLP与GDI1平行调控ROP2的质膜定位及稳定性 GDIs作为ROP的重要调控因子，其功能缺失导致ROP2的异常分布，根毛产生多个起始及分叉。通过构建GDI1突变体scn1-1和plp-3的双突变体，我们发现plp-3能够抑制scn1-1根毛多个起始的表型，plp-3;scn1-1双突中根毛变成了气球状（balloon）而非管状形态。通过分析ROP2的亚细胞定位，我们发现双突根毛表现为两种单突变体表型的加和。此外，生化数据表明PLP及GDI1都调控ROP2蛋白的稳定性。以上结果表明PLP和GDI1平行调控ROP2的质膜定位及稳定性。 （5）光敏色素phyB负调控根毛顶端生长 自然界中植物根毛一般生长在地下黑暗的环境中。野生型拟南芥根毛在黑暗下比光照条件下明显变短，密度降低，宽度增加。基于此现象，我们利用正向遗传学方法，通过EMS诱变，筛选获得了几个黑暗中根毛长度增加的拟南芥突变体。其中一个经图位克隆，确定其突变基因为PHYB，将其命名为phyB-11。通过分析PHYB启动子驱动的GUS转基因材料，发现PHYB在根毛延伸阶段高量表达。phyB-11与野生型相比，根毛长度显著增加，而宽度及密度没有变化。我们分析发现phyB-11的根毛在顶端生长阶段生长速度显著快于野生型，暗示phyB抑制根毛延伸。 （6）PhyB负调控ROP2的活性及质膜定位 ROP2作为根毛生长过程中的“分子开关”,对于根毛延伸至关重要，而phyB可以抑制根毛延伸，据此我们推测两者之间存在生物学联系。为了验证这一假设，我们将ProE7启动子驱动的GFP-ROP2引入phyB-11中。发现phyB-11中ROP2的质膜信号增强，质膜与胞质间信号的比值增大。生化分析的结果显示phyB-11突变体中ROP2更多的定位于质膜，并且活性形式的ROP蛋白量增加，暗示phyB负调控ROP2在根毛质膜上的定位及其活化。 （7）PhyB在胞质内通过GEF10负调控根毛生长 PhyB的亚细胞定位受到光的调控。通过分析PHYB-GFP的转基因材料，我们发现无论叶片是否受到光照，根毛在黑暗环境时phyB都定位于根毛细胞的胞质中，暗示phyB在根毛的胞质中发挥功能。此外，ProE7启动子驱动的无法入核形式的phyBG767R能够互补phyB-11突变体根毛变长的表型，进一步确认了phyB在胞质内负调控根毛延伸这一结论。利用Pull down实验、酵母双杂实验和双分子荧光互补实验，我们证实phyB与ROP的活化因子GEF10在胞质内相互作用。通过构建phyB-11和gef10的双突变体，我们发现gef10能够抑制phyB-11根毛变长的表型。以上结果表明根系生长在黑暗环境时，根毛中phyB主要在胞质发挥功能，其通过与GEF10直接互作调控根毛生长。 （8）PhyB与FER竞争性的结合GEF10 类受体激酶FER在根毛的生长过程中通过与GEFs结合来调控ROP2的活性。我们发现当phyB存在时，FER与GEF10的相互作用明显减弱。通过构建phyB-11和fer-4的双突变体，我们发现双突根毛表现出fer-4的表型，这表明FER位于phyB的遗传学下游。以上结果暗示phyB通过与FER竞争性的结合GEF10，调控根毛顶端生长。

目录

声明

符号说明

1前言

1.1根毛

1.1.1根毛的命运决定

1.1.2根毛的起始

1.1.3根毛的顶端生长

1.1.4根毛的成熟

1.2小G蛋白ROP的研究现状

1.2.1小G蛋白ROP

1.2.2小G蛋白ROP家族的分类及功能

1.2.3小G蛋白ROP的调控因子GEFs、GAPs和GDIs

1.2.4 小G蛋白ROP调控的下游细胞活动

1.2.5 小G蛋白ROP调控植物根毛生长

1.3异戊烯化修饰的研究现状

1.3.1异戊烯化修饰

1.3.2植物中异戊烯化修饰的研究进展

1.4光敏色素的研究现状

1.4.1植物的感光系统

1.4.3光敏色素家族的分类

1.4.4光敏色素的功能

1.4.5光敏色素亚细胞定位的调控

1.4.6光敏色素对于ROP信号通路的调控

1.5 RLKs调控植物根毛生长的研究现状

1.5.1 RLKs调控根毛生长

1.5.2 FER调控根毛生长

1.6本研究的目的和意义

2材料与方法

2.1材料

2.1.1植物材料及生长条件

2.1.2菌株和质粒

2.1.3 PCR引物

2.1.4酶与各种生化试剂

2.2方法

2.2.1构建转基因植物表达载体

2.2.2拟南芥转化实验（农杆菌法）

2.2.3 qRT-PCR

2.2.4 EMS诱变和图位克隆

2.2.5 根毛的GUS染色分析

2.2.6图像采集及处理

2.2.7 药剂处理及荧光染料染色

2.2.8酵母双杂交实验（Y2H）

2.2.9双分子荧光互补实验

2.2.10 Pull down

2.2.11膜蛋白的提取

2.2.12植物蛋白的提取

2.2.13 MG132处理

2.2.14原核蛋白的表达

2.2.15原核蛋白的纯化

2.2.16植物体内活性小G蛋白的提取和检测

2.2.17蛋白免疫印迹（Western-blot）

3结果与分析

3.1 异戊烯化修饰酶（PLP）正调控根毛生长

3.1.1 PLP正调控根毛生长

3.1.2 PLP正调控ROP2质膜定位

3.1.3 PLP正调控微丝骨架的动态组装和活性氧（ROS）的产生

3.1.4 PLP正调控反面高尔基运输过程

3.1.5 PLP与GDI1平行调控ROP2靶向

3.1.6 PLP与GDI1平行影响ROP2的稳定性

3.2 光敏色素B（phyB）负调控根毛顶端生长

3.2.1 黑暗抑制根毛生长

3.2.2 PhyB负调控根毛生长

3.2.3 PhyB负调控根毛顶端生长

3.2.4 PhyB负调控ROP2的蛋白活性及膜定位

3.2.5 PhyB负调控ROS的产生

3.2.6胞质定位的phyB负调控根毛生长

3.2.7 PhyB与GEF10在细胞质中相互作用

3.2.8 PhyB与FER竞争性的结合GEF10

3.2.9 PhyB通过FER-GEF10调控根毛生长

4讨论

4.1 PLP正调控根毛生长

4.2 PLP正调控根毛中ROP2质膜定位

4.3 PLP和GDI1平行调控ROP2的靶向及稳定性

4.4 PhyB负调控根毛顶端生长

4.5 PhyB通过与FER竞争性的结合GEF10抑制ROP信号通路

5 结论

5.1 拟南芥异戊烯化修饰酶PLP与GDI平行调控ROP2的定位和稳定性

5.2 PhyB负调控根毛顶端生长过程中ROP信号的传导

参考文献

致谢

攻读学位期间发表论文情况