H9N2亚型禽流感病毒感染TC-1细胞在mRNA水平和蛋白水平的免疫反应分析

摘要

H9N2亚型禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）属于低致病性禽流感病毒，感染畜禽后只引起轻微症状，但其流行很广泛，给养殖业造成了巨大的损失，至今仍是重点预防控制家禽疫病之一。此外，该亚型AIV还能够跨越种间屏障感染哺乳动物和人，对公共卫生造成威胁。自1999年以来在我国大陆和香港地区相继报道了人感染H9N2亚型AIV的病例，虽然其感染仅能引起人的一些轻微的呼吸道症状和产蛋下降，但是当其它病原混合感染后，病情会加重。此外，H9N2亚型AIV极易发生突变与重组，产生新的、危害性更大的变异毒株，如H7N9的6个内部基因来源于该亚型。所以说H9N2亚型禽流感病毒是影响公众健康的一个潜在威胁。
　　多年来，对H9N2AIV的研究主要集中在它的病原学、流行病学以及控制技术上，而对宿主感染的免疫应答过程及其机制了解甚少。基于此，本研究对宿主的免疫反应做了初步的研究。首先，为了挑选出对TC-1细胞较为敏感的H9N2亚型禽流感病毒，对实验室保存的5株H9N2亚型禽流感病毒进行了病毒滴度的测定以及间接免疫荧光实验的检测。对比显示：CK/SD/ch的病毒滴度最高，CK/SD/w3次之，而后依次是CK/SD/01、CK/SD/836-F1，CK/SD/w4病毒滴度最低。各株禽源流感病毒的毒力强弱不同，但是都能在哺乳细胞上有效复制，这为后续研究病毒的跨种传播奠定了基础。
　　为揭示在流感病毒感染过程中，模式识别受体表达量的多少，以反应机体的天然免疫应答状况。本研究通过荧光定量PCR和ELISA两种方法，对三种模式识别受体TLR-3、RIG-I和MDA-5分别在mRNA水平和蛋白水平上进行了检测。结果显示，在mRNA和蛋白水平上，MDA-5在这三种模式识别受体中所起的作用更加明显，上调幅度最大，mRNA和蛋白水平上分别最大上调11.5倍和7.5倍。而RIG-I和TLR-3在整个过程中也有所上调，但上调的倍数相对较小一些，mRNA和蛋白水平上最大上调倍数仅有4.8倍和5.6倍。对本研究所用的三株流感病毒进行比较发现，在mRNA水平上CK/SD/w3所引起的模式识别受体的上调明显，在各个时间点的上调倍数较另外两株高0.2-1.4倍。在蛋白水平上，在各个时间点引起的上调差异不大，三株毒在18h时引起的TLR-3上调仅约为1.16倍，在24h时引起MDA-5上调约为6.4倍，三株毒间差异不明显。
　　为阐明机体组织细胞抗 AIV的炎症反应过程，采用细胞因子指示其程度。通过荧光定量PCR和ELISA两种方法对4种细胞因子即IL-1β、IL-6、TNF-α和IFN-β进行了检测。结果显示，在mRNA水平上，IL-1β、IL-6和IFN-β上调倍数相对较大，最大上调倍数分别为19.0倍、21.9倍和24.1倍。而TNF-α的上调倍数相对较小一些，最大上调倍数仅有6.3倍。在本研究所用的三株流感病毒中，CK/SD/w3所引起的IL-1β、IL-6和IFN-β的上调倍数较大（18.0-25.0倍）；在蛋白水平上各种细胞因子的上调倍数基本相似，在6h、12、和18h时上调不明显，甚至有些细胞因子有些许下调。值得注意的是在蛋白水平上，各个时间点，各个毒株间细胞因子的上调倍数差异性不大，且上调倍数不大，仅仅有2-4倍的上调。这些细胞因子均为促炎症因子，参与机体的抵抗流感病毒的免疫反应。生理状态下，这些细胞因子的含量很低，但是在机体遭受侵害的情况下，这些因子快速，大量的释放导致炎症反应促进疾病的进程。
　　趋化因子在动物机体中也是一种重要的免疫因子，它在趋化炎症因子到达炎症反应部位过程中作用明显。因此本研究还对5种趋化因子（IL-8、Ccl-2、Ccl-3、RAN TES和IP-10）进行了检测。结果显示：在mRNA水平上，这几种趋化因子都有明显的上调，上调倍数最大的是Ccl-3（最大上调倍数为19.1倍）。在蛋白水平上，上调最明显的为RANTES，最大上调倍数为35.9倍。而在各个毒株之间进行比较发现，mRNA水平上，CK/SD/w3和CK/SD/w4实验组的各种趋化因子上调均很明显，CK/SD/w3在12h时诱导Ccl-3上调倍数最大（19.1倍），CK/SD/w4在36 h时诱导IL-8上调倍数最大为17.1倍。而CK/SD/ch仅仅对Ccl-3的上调较为明显（上调倍数为12.5倍）。在蛋白水平上，三株毒在各个时间点的各种趋化因子上调倍数差异不明显，但是CK/SD/w3诱导上调的倍数更大一些。这些趋化因子由单核细胞、巨噬细胞分泌产生，在机体中趋化因子可以招募游离的单核细胞、中性粒细胞和淋巴细胞穿过血管内皮到达炎症部位。趋化因子上调越明显，说明招募的炎性细胞和炎性因子越多，而引起的炎症反应越严重。

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1．引言

1.1病毒粒子结构

1.2流感病毒的敏感性

1.3禽流感病毒的基因组结构

1.3.1血凝素（Hemagglutinin，HA）

1.3.2神经氨酸酶（Neuraminidase，NA）

1.3.3聚合酶蛋白（ PB1、PB2、PA）

1.3.4核蛋白（NP）

1.3.5基质蛋白

1.3.6非结构蛋白(NS)

1.4禽流感病毒的变异

1.4.1抗原漂移

1.4.2抗原的转变

1.4.3致病性的变异

1.5禽流感病毒感染哺乳动物及人致病机制的研究进展

1.6天然免疫系统与病毒感染关系的研究进展

1.6.1模式识别受体

1.6.2病毒与炎症反应的研究

1.7研究目的和意义

2 材料方法

2.1材料

2.1.1病毒株

2.1.2 实验中所用鸡胚、细胞及抗体

2.1.3主要试剂及试剂盒

2.1.4主要实验溶液的配置

2.1.5主要仪器

2.2方法

2.2.1 H9N2亚型AIV对哺乳动物的感染

2.2.2 AI V增殖与纯化

2.2.3病毒TCID50的测定

2.2. 4病毒在TC-1细胞上复制能力的检测

2.2.5模式识别受体荧光定量PCR方法的建立

2.2.6荧光定量PCR检测TC-1细胞模式识别受体及细胞因子和趋化因子表达量

2.2.7 ELISA检测模式识别受体及细胞因子和趋化因子

3结果

3.1 5株H9N2亚型禽流感病毒TCID50的检测

3 .2 5株H9N2亚型AIV在TC-1细胞上增殖能力的检测结果

3.2.1病毒增殖曲线

3.2.2 间接免疫荧光实验检测结果

3.3荧光定量检测模式识别受体及细胞因子

3.3.1模式识别受体荧光定量PCR引物的验证

3.3.2荧光定量PCR检测模式识别受体方法的建立

3.3.3荧光定量PCR的敏感性实验

3.3.4荧光定量PCR的重复性实验

3.3.5荧光定量检测模式识别受体

3.3.6荧光定量检测细胞因子

3.3.7荧光定量检测趋化因子

3.4 ELISA检测模式识别受体及细胞因子

3.4.1 ELISA检测模式识别受体

3.4.2 ELISA检测细胞因子

3.4.3荧光定量检测趋化因子

4.讨论

4.1研究目的

4.2材料和方法的选择

4.3病毒敏感性的检测

4.4模式识别受体和免疫因子的检测

4.4.1模式识别受体的表达

4.4.2细胞因子的表达

4.4.3趋化因子的表达

5.结论

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表论文情况