山东地区病死鸭胚中细菌的分离鉴定及大肠杆菌分子流行病学调查

摘要

鸭胚在孵化的过程中会有多种原因致使胚体死亡，胚胎发育受阻，孵化率降低。其中细菌感染是非常重要的因素，并且因为其广泛的传播性和抗生素的滥用，各种致病菌耐药性的增强，细菌感染已经给养鸭业造成了严重的损失。
　　2014年9月份以来，山东规模化种鸭孵化场的胚胎死亡率和弱雏率明显升高，死亡鸭胚的类型以臭蛋为主，然而该孵化场的消毒工作做的非常到位，鸭群中并未出现明显的发病状况，所以初步怀疑为种源性细菌感染所致。为进一步探讨和研究引起该种蛋孵化场鸭胚致死的原因，本研究通过对死亡鸭胚中细菌的流行病学调查及对其某些分子生物学方面的研究，为阐释鸭胚死亡原因和细菌性疾病的预防提供理论依据。
　　本研究共分五部分。
　　1.死亡鸭胚中细菌的分离鉴定
　　通过的对蛋壳无破损的死亡鸭胚细菌分离培养、形态染色、16S rDNA基因检测等检测方法对11个批次的220枚死亡鸭胚进行细菌的分离鉴定，其中175枚鸭胚中存在细菌的感染，共分得细菌187株，21种不同的菌株，混合感染的有13枚，细菌的感染率为79.5％。187株细菌中，大肠杆菌98株（52.4%），沙门氏菌15株（8.6%），奇异变形杆菌21株（11.2%），其他克雷伯肺炎菌、绿脓杆菌、沙雷氏菌等18个菌种有53株（27.8%）。结果表明，造成该种鸭场孵化率和弱雏率上升的主要原因是细菌感染所致，并且主要致病菌为大肠杆菌、沙门氏菌、奇异变形杆菌。
　　2.主要的致病菌的耐药性调查
　　采用Kirby-Bauer法对分离鉴定的98株鸭源大肠杆菌，16株鸭源沙门氏菌，21株鸭源奇异变形杆菌进行18种抗生素(头孢噻吩、四环素、卡那霉素、诺氟沙星等)的耐药性检测，结果显示，三种主要致病菌对18种抗生素的表现出不同程度的耐药，其中大肠杆菌敏感性较高的几种抗生素为庆大霉素（82.7%），卡那霉素（54.1%），链霉素（71.4%），呋喃妥因（84.7%），新霉素（59.2%），多粘菌素B（95.9%）。沙门氏菌敏感性较高的抗生素为氨苄西林（75.0%），头孢噻吩（75.0%），庆大霉素（93.7%），卡那霉素（81.2%），链霉素（100%），四环素（93.7%），环丙沙星（93.7%），诺氟沙星（93.7%），氯霉素（87.5%），头孢氨苄（75.0%），新霉素（100%），多粘菌素B（100%）。奇异变形杆菌敏感性较高的抗生素为头孢噻吩（57.1%），庆大霉素（80.9%），链霉素（71.4%）。该项研究调查表明，在治疗和预防山东地区种鸭孵化场致病性细菌感染时可以选择性地使用链霉素和庆大霉素，同时也为针对性地预防和控制某种细菌病原感染提供理论依据。
　　3.鸭源大肠杆菌的Eric-PCR分型鉴定
　　采用非加权对数算术平均法，在相似性系数为0.7时，98株大肠杆菌明显分为A、B、C、D、E、F、G、H8个类群，主要类群为B型，含有32株菌。相似性系数为100%共有14组，其中组成员数最多为11株菌，最少为2株。B类群大肠杆菌在7批死胚中都出现过，说明B类群大肠杆菌可能在整个山东省广泛传播。不同基因型的大肠杆菌在不同的分菌批次有比较大的差异性和随机性，说明不同地区大肠杆菌的流行状况有很大的差异，存在着地域性差别。
　　4.鸭源大肠杆菌LPS外核心多糖分型鉴定
　　运用LPS外核心多糖的PCR分型方法对分离出来的大肠杆菌进行基因分型，结果为R1（71.4%），R2（6.1%），R3（8.2%），R4（12.2%），K12（2.1%）。该结果显示，山东地区种鸭中比较流行的大肠杆菌LPS外核心多糖类型为R1，该核糖型的流行病学调查为其种鸭场对大肠杆菌病的预防保护和治疗提供了理论依据。
　　5.鸭源大肠杆菌毒力基因的检测与鉴定
　　利用毒力基因多重 PCR检测方法对所分离到的鸭源大肠杆菌进行毒力基因的检测和鉴定，结果分离强毒株33株（33.2%）。其中fimC，Mat，ibeB，Vat四种基因有非常高的检出率，此项调查对禽致病性大肠杆菌的长期监测和研究提供了理论依据。

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英文摘要

1 前 言

1.1 大肠杆菌

1.2 沙门氏菌

1.3 奇异变形杆菌

1.4 细菌的检测方法

1.5 大肠杆菌的Eric-PCR技术

1.6 大肠杆菌LPS外核心多糖

1.7 大肠杆菌毒力基因

1.8 本研究的目的意义

2 材料与方法

2.1 材料

2.2方法

3 结 果

3.1 死亡鸭胚中细菌的分离鉴定结果

3.2 主要致病菌的药敏试验结果

3.3 鸭源大肠杆菌的Eric-PCR分型鉴定结果

3.4 鸭源大肠杆菌LPS外核心多糖分型鉴定结果

3.5 鸭源大肠杆菌毒力基因检测与鉴定结果

4 讨 论

4.1 死亡鸭胚中细菌的流行状况

4.2 主要致病菌进行药敏试验检测

4.3鸭源大肠杆菌Eric-PCR分型鉴定

4.4鸭源大肠杆菌LPS外核心多糖分型

4.5鸭源大肠杆菌毒力基因的分型鉴定

5 结 论

参考文献

附录

致谢

攻读硕士期间发表论文情况