鸡MTNR1A基因启动子克隆及活性分析

摘要

MTNR1A基因编码褪黑激素受体1A，是影响鸡产蛋性状的候选基因。通过对MTNR1A基因启动子区的功能分析，有助于从分子水平上了解MTNR1A基因可能的调控序列及转录调控机制，对进一步了解褪黑激素参与生殖调控的作用机制也有一定作用。
　　本试验以海兰褐壳蛋鸡为研究对象，采用PCR方法扩增了鸡MTNR1A基因5’调控区3134bp到205bp长度不同、下游引物相同的七个片段，对其进行克隆、测序后，构建了七个启动子报告基因表达载体，瞬时转染鸡卵泡膜细胞，应用双荧光素酶报告基因检测系统测定了荧光素酶相对活性，并对产生作用的区段进行生物信息学分析。同时，PCR扩增31只鸡MTNR1A基因5’调控区-941~+107区域进行测序，寻找其SNP位点，对SNP位点进行遗传学分析，并对突变前后基因序列进行生物信息学分析。结果表明：
　　（1）-243~-39区段能表达MTNR1A基因启动子的基本活性。生物信息学分析表明，该区域包含TATA box、CCAAT box等典型的核心启动子元件。表明-243~-39区段对该基因的表达调控起重要作用。
　　（2）启动子分析载体由-553~-39删除至-243~-39时，荧光素酶活性显著下降，表明-553~-243间有增强MTNR1A基因表达的作用元件。该区域存在多个SP1结合位点和USF结合位点，推测这两种结合位点对-553~-243区域活性增强起重要作用。
　　（3）启动子分析载体由-1963~-39删除至-1525~-39时，荧光素酶结果显著升高，表明-1963~-1525间有降低MTNR1A基因表达的作用元件。推测该区域的AP-1结合位点、HNF-1结合位点、USF结合位点及Arnt反式作用因子发挥降低启动子活性的作用。
　　（4）启动子分析载体由-2373~-39删除至-1963~-39时，荧光素酶活性显著降低，表明从-2373~-1963区域中存在增强MTNR1A基因表达的作用元件。推测该区域的TATA box、AP-1结合位点、c-Myb结合位点、USF结合位点和Oct-1反式作用因子起到增强-2373~-1963区域活性的作用。
　　（5）启动子-941~+107区域存在6个SNPs位点：-34（C→T），-100(T→G)，-110(T→C)，-126(C→T)，-151(G→A)，-538(T→G)，处于Hardy-Weinberg平衡状态。其中2个突变可能造成转录因子结合位点的改变。
　　综上所述，本试验证明MTNR1A基因-553~-243和-2373~-1525区段是调控该基因表达的重要作用区段；5’调控区-941~+107存在2个突变可能造成转录因子结合位点的改变。

目录

封面

声明

符号说明

目录

中文摘要

英文摘要

1引言

1.1启动子及其研究方法

1.1.1启动子概述

1.1.2启动子构成

1.1.3启动子活性检测和功能分析

1.2褪黑激素及受体的研究进展

1.2.1 褪黑激素的发现、结构及分布

1.2.2褪黑激素的合成及对生殖的调控

1.2.3褪黑激素受体的发现及分类

1.2.4褪黑激素受体1A的结构与功能

1.3褪黑激素受体1A基因的研究进展

1.3.1褪黑激素受体1A基因的结构

1.3.2褪黑激素受体1A基因的表达

1.3.3褪黑激素受体1A基因SNP研究及检测方法

1.3.4褪黑激素受体1A基因在卵巢中的研究

1.4目的与意义

2材料与方法

2.1试验材料

2.1.1试验动物和样品采集

2.1.2主要仪器设备

2.1.3主要试剂及来源

2.1.4主要数据库和分析软件

2.1.5常用试剂的配制

2.2试验方法

2.2.1鸡血液基因组DNA提取

2.2.2 MTNR1A 5’调控区启动功能分析

2.2.3 MTNR1A基因5’调控区SNPs检测

2.2.4数据统计分析

3试验结果与分析

3.1 MTNR1A启动子区启动活性检测结果与分析

3.1.1调控区域转录因子结合位点的预测

3.1.2启动子不同长度片段的PCR扩增

3.1.2启动子区片段报告基因分析载体的构建及检测

3.1.3鸡MTNR1A基因启动子区片段荧光素酶活性检测结果

3.1.4鸡MTNR1A基因启动子的生物信息学分析

3.2海兰褐壳蛋鸡MTNR1A 基因5’调控区SNPs检测及分析

3.2.1海兰褐壳蛋鸡MTNR1A 基因5’调控区SNPs检测结果

3.2.2 SNPs位点的TFSEARCH分析

3.2.3 MTNR1A基因5’调控区SNPs位点群体遗传学分析

4讨论

4.1鸡MTNR1A启动子区启动功能分析

4.2鸡MTNR1A 5’调控区SNPs研究

5结论

参考文献

致谢