鸡ERα基因启动子的活性分析及其剪切体的时空表达研究

摘要

禽类性别分化和性腺发育一直是禽类发育生物学研究的热点，但具体的性别分化及性腺发育的调控机制还有待进一步研究。研究发现与生殖系统发育及其功能维持密切相关的雌激素受体基因ERα在鸡性别决定早期性腺发育中有重要作用。已有研究表明ERα基因具有多个启动子，且不同启动子的转录产物不同（即存在不同剪切体），本研究首先拟对ERα基因5'上游区域进行研究，找出多个启动子的活性差异，在此基础上研究单个启动子调控的选择性剪切变体在鸡胚发育期及成年开产期不同组织中的表达差异，并与多个启动子调控的ERα总表达进行比对，探究二者之间的关系。实验采用双荧光素酶报告基因系统的方法，对构建的ERα基因启动子缺失片段进行启动子活性检测;用半定量RT-PCR的方法对剪切体和ERα的表达进行定量分析。具体结果如下:
　　1、用3种细胞对含启动子缺失片段的双荧光素酶报告载体进行转染实验并进行启动子活性检测，发现DF1细胞的转染实验未检测出启动子活性，PK15和Hela细胞的转染实验检测出启动子活性差异，活性依次为ERαPF1(+52_216)＞ERαPF3(-238～+216)＞ERαPF4(-403～+216)＞ERαPF2(-65～+216)＞ERαPF5(-2125～+216),初步认为双荧光素酶报告载体具有细胞特异性，另外ERα基因启动子活性差异可能与基因调控通路中多种转录因子或者启动子之间的相互作用有关。
　　2、通过对不同胚龄(E10.5、E12.5、E14.5、E16.5、E18.5)鸡胚及6月龄成年鸡多种组织中C启动子转录的C剪切体的半定量检测，发现C剪切体具有组织特异性，只在肝脏组织中表达，且C剪切体的表达呈现出发育时期特异性及性别差异，另外在E14.5雄性胚胎肝组织中存在某种因子引起C剪切体的表达下调，这可能与启动子的表观修饰或者其他因素有关。
　　3、通过对肝脏组织中多启动子调控的ERα总表达的半定量检测，发现6月龄成年鸡的两性肝脏组织中ERα的表达呈极显著差异，而胚胎期无差异，推测雌雄肝脏中的ERα差异表达极有可能与开产母鸡体内肝脏中蛋黄蛋白等的合成有关。
　　4、通过与肝脏中ERα的表达进行对比，发现当雌雄两性间C剪切体表达为雌性大于雄性时，ERα表达则为雌性小于雄性，反之亦然。可以初步推测在雌雄两性间C剪切体表达与ERα的表达呈负相关，即C启动子与ERα的多启动子负相关。
　　5、通过对6月龄成年鸡多种组织中ERα及其D启动子调控的D剪切体的半定量检测，发现ERα及其D剪切体在所测组织中均有表达，输卵管中ERα表达大于输精管，而D剪切体的表达小于输精管，初步推测在6月龄成年母鸡体内出现了某种调控机制对启动子D进行了负调控，使得D剪切体在输卵管中的表达量下降，但是由于ERα具有多个启动子，因此ERα表达量未受影响。
　　6、通过对5个时期雌雄两性鸡胚组织中ERα及其D剪切体的半定量检测，发现二者在性腺中的表达量最高。与另外几种组织相比，肝脏中ERα的表达水平相对较高，D剪切体的表达水平相对较低。初步推测D启动子与鸡胚发育期性腺中ERα的表达正相关，而与肝脏中ERα的表达负相关。

目录

声明

摘要

缩略词表

1 前言

1．1 研究问题的由来

1．2 禽类性别决定及性腺发育相关的研究进展

1．2．1 禽类性别决定及性腺分化

1．2．2 性激素与禽类性别分化的关系

1．2．3 核激素受体及ERα的研究进展

1．3 选择性剪切及ERα选择性剪切的相关研究进展

1．3．1 选择性剪切

1．3．2 ERα基因的选择性剪切

1．4 研究目的与意义

1．4．1 研究目的

1．4．2 研究意义

2 材料和方法

2．1 材料

2．1．1 主要试剂及溶液的配制

2．1．2 主要器材

2．1．3 生物信息学分析相关的软件和数据库

2．2 方法

2．2．1 鸡ERα基因启动子活性检测

2．2．2 半定量RT-PCR检测ERα基因不同剪切体

3 结果与分析

3．1 ERα基因不同启动子缺失片段的活性检测

3．1．1 启动子缺失片段的扩增

3．1．2 双荧光素酶报告基因载体的构建

3．1．3 细胞培养及转染

3．2 ERα基因不同剪切体时空表达的检测

3．2．1 鸡胚组织提取、性别鉴定、RNA提取及cDNA的制备

3．2．2 不同时期不同组织中C剪切体的半定量检测

3．2．3 不同时期不同组织中D剪切体的半定量检测

4 讨论

4．1 不同细胞中ERα基因启动子活性检测的研究

4．2 不同时期肝脏中ERα基因及其C剪切体表达的研究

4．3 6月龄成年鸡中ERα基因及其D剪切体表达的研究

4．4 不同胚胎期中ERα基因及其D剪切体表达的研究

5 小结

5．1 本研究所取得的结果

5．2 下一步需要研究的问题

参考文献

致谢