鸡ERα基因胚胎组织表达差异及其启动子活性分析

摘要

禽类作为研究其他脊椎动物的重要模式生物，其性别分化和性腺发育的相关研究一直是发育生物学的研究热点。性激素在性别分化和性腺发育方面起到了重要的作用，有研究表明雌激素合成的关键酶芳香化酶可以导致雄性鸡胚的雌性化，这说明雌激素在鸡胚早期性腺发育中起到重要作用。
　　鸡雌激素受体cERα基因有五个启动子，分别启动转录形成多个5'UTR不同的cERα mRNA剪切体，本研究拟对鸡胚胎期cERα基因的多个剪切体进行研究，用实时荧光量PCR的方法对cERα基因多个剪切体在鸡胚五个时期八个组织中的表达情况进行检测。
　　实验结果表明cERα基因的B、C、D三种剪切体在鸡胚五个时期(E10.5、E12.5、E14.5、E16.5、E18.5)八个组织（心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脑泡、肌肉、性腺）中均有表达，在性腺中表达量最高，且在雌雄两性中呈现表达差异，均为雌性表达量高于雄性;根据cERα基因的B、C、D三种剪切体均在性腺中高表达的实验结果，进一步对三种剪切体在性腺中的相对表达情况进行了定量检测，发现三种剪切体在不同时期性腺中的相对表达趋势基本一致，且雌性均在E14.5时表达量下调，三种剪切体的相对表达水平表现为C＞D＞B;同时使用双荧光素酶报告基因系统的方法在CEF、DF1和PK15三种细胞系中对六个启动子(A1、A2、A12、B、C、D)重组载体进行了活性检测，结果发现在CEF、DF1细胞中均检测到了启动子活性，PK15细胞中没有检测到启动子活性。CEF细胞中启动子重组载体相对活性表现为D＞B＞C＞A12＞A1＞A2，DF1细胞中相对活性为D＞A12＞A2＞C＞B＞A1，其中D启动子的活性均远高于其他几个启动子，启动子重组载体A12（包含启动子A1和A2）的活性均大于单独的启动子A1和A2，推测启动子A1和A2之间存在互作。

目录

论文说明

声明

摘要

缩略词表

1 前言

1．1 研究问题的由来

1．2 鸡的性别决定及性分化机制

1．2．1 性别决定假说

1．2．2 性腺的发育过程

1．3 雌激素与性别分化

1．3．1 雌激素

1．3．2 ERα基因

1．4 ERα基因的选择性剪切

1．4．1 选择性剪切

1．4．2 ERα的选择性剪切

1．5 研究目的与意义

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 主要载体和细胞系

2．1．2 主要试剂及溶液的配制

2．1．3 主要仪器

2．1．4 生物信息学分析相关软件和数据库

2．2 方法

2．2．1 实时荧光定量PCR检测

2．2．2 双荧光素酶基因报告载体检测ERα基因启动子的活性

2．2．3 细胞培养及质粒转染

3 结果

3．1 ERα基因不同剪切体表达情况的检测

3．1．1 B剪切体在不同时期各组织中的相对表达量

3．1．2 C剪切体在不同时期各组织中的相对表达量

3．1．3 D剪切体在不同时期各组织中的相对表达量

3．1．4 B、C、D三种剪切体在不同时期性腺中的相对表达量

3．2 ERα基因不同启动子活性检测

3．2．1 双荧光素酶报告基因重组载体的构建

3．2．2 双荧光素酶活性的检测

4 讨论

4．1 ERα基因剪切体在不同时期各组织中具有不同的表达水平

4．2 ERα基因启动子在不同细胞中具有不同的活性

5 小结

5．1 本研究所取得的结果

5．2 下一步需要研究的问题

参考文献

致谢