多小RNA组合介导的对PVYO与PVYN抗性比较研究

摘要

马铃薯Y病毒脉坏死株系（PVYN）和马铃薯 Y病毒普通株系（PVYO）是马铃薯Y病毒（Potato virus Y，PVY）的两个主要株系，侵染烟草后分别会引发系统脉坏死和系统性斑驳的症状。amiRNA（ artificial microRNA， amiRNA）和 siRNA（small interfering RNA，siRNA）是两种类型的沉默介导因子。这两类小 RNA（sRNA），近年来被广泛应用于植物抗病毒研究。本研究以 PVYO的复制酶基因 NIb的两个区域作为靶序列，分别设计 siRNA和 amiRNA，构建4个含有单 sRNA的植物表达载体和4个含有双 sRNA的植物表达载体，转化烟草，进行抗病性鉴定，比较研究了多 sRNA的组合对病毒抗性的影响。研究结果为利用 RNA沉默策略高效培育抗病毒转基因植物提供了依据。主要的实验结果和结论如下：
　　（1）以 PVYO复制酶基因 NIb的两个区域作为靶序列，按照相关准则分别设计siRNA和 amiRNA，构建8个植物表达载体: pR-siR1， pR-siR2， pR-miR1， pR-miR2，pR-siR1siR2，pR-miR1miR2，pR-siR1miR2和pR-miR1siR2。
　　（2）以荧光素酶（luciferase，LUC）作为报告基因与靶基因连接，构建融合基因的表达载体PVYN-NIb-LUC和PVYO-NIb-LUC。将PVYN-NIb-LUC和PVYO-NIb-LUC分别与sRNA表达载体瞬时共侵染本生烟，结果显示，sRNA表达载体对PVYO-NIb-LUC的剪切效率均高达90％以上,尤其是同时表达 siRNA和 amiRNA的表达载体，剪切效率最高可达94.3%；sRNA表达载体对PVYN-NIb-LUC的剪切效率为29%-41.5%，但共表达siRNA和amiRNA仍具有相对较高的剪切效率。
　　（3）将构建的8种sRNA表达载体，利用冻融法导入农杆菌LBA4404，叶盘法转化烟草 NC89，获得转基因植株，利用卡那霉素抗性筛选和 PCR检测，获得各转基因的植株150株以上。
　　（4）转基因植株的Northern blot分析和荧光定量PCR检测表明，各转基因株系中均有 sRNA积累，但是积累量存在差异：含双 sRNA的转基因株系 pR-miR1miR2、pR-miR1siR2、pR-siR1siR2、pR-siR1miR2，sRNA表达量累加后高于含单 sRNA的转基因株系pR-miR1、pR-miR2、pR-siR1、pR-siR2，其中pR-siR1miR2、 pR-miR1siR2株系的sRNA积累量最高。
　　（5）用含有 PVYN和 PVYO的病毒汁液接种转基因烟草各株系，进行抗病性分析。统计结果表明， pR-miR1miR2、pR-miR1siR2、pR-siR1siR2、pR-siR1miR2、pR-miR1、pR-miR2、pR-siR1、pR-siR2对 PVYN的抗病率分别为29.33%、34.54%、24.54%、46.95%、18.80%、21.35%、4.04%、8.57%；对 PVYO的抗病率分别为52.34%、59.88%、47.25%、69.04%、43.20%、47.12%、42.82%、44.48%。上述结果表明，8种 sRNA表达载体的转基因植株均对 PVYO表现出较高的抗性，尤其是共表达siRNA和 amiRNA的转基因植株，抗病率最高可达近70%；推测是由于碱基错配造成转基因植株对 PVYN的抗性相对较低，但共表达 siRNA和 amiRNA的转基因植株仍可介导相对较高的抗性水平，表明这样的组合方式能有效减少错配造成的病毒逃逸。
　　（6）抗病和感病转基因植株 Northern blot分析结果显示，转基因在 RNA水平上得以表达，并且抗病植株中 mRNA的积累量明显低于同类型的感病植株；抗病转基因植株中sRNA的积累高于感病植株；表明病毒抗性是由RNA介导的，抗性与sRNA积累量成正相关。
　　（7）转基因植株 Southern blot分析结果显示，外源基因已经成功整合到烟草的基因组中，部分转 pR-siR1miR2、pR-miR1siR2的高抗病毒植株中，存在1-2个拷贝的转基因。
　　（8）对 T1代进行抗病性分析发现，高抗型转基因植株的后代仍保持对病毒的高度抗性，表明siRNA和amiRNA介导的抗性稳定遗传到T1代。

目录

声明

符 号 说 明

1 前言

1.1马铃薯Y病毒及其基因组结构

1.2植物抗病毒基因工程

1.3基因沉默

1.3.1小干扰RNA

1.3.2微小RNA

1.3.3人工microRNA

1.3.4多sRNA策略与植物病毒抗性

1.4本研究的目的与意义

2材料与方法

2.1材料

2.1.1毒源

2.1.2植物材料

2.1.3所需的菌株、质粒、pre-miRNA

2.1.4实验试剂

2.2方法

2.2.1 siRNA、amiRNA植物重组表达载体构建

2.2.2 PVY-LUC-NIb植物表达载体的构建

2.2.3农杆菌介导的瞬时共表达

2.2.4转基因烟草的培育

2.2.5 CTAB法小提烟草的总DNA

2.2.6转基因烟草植株的PCR鉴定

2.2.7 Northern blot分析T0代转基因植株sRNA表达量

2.2.8对转基因植株进行抗性鉴定及ELISA检测

2.2.9 mRNA的Northern杂交

2.2.10 Southern杂交分析

2.2.11荧光定量PCR

2.2.12 T1代遗传分析

3结果与分析

3.1靶序列的确定

3.2 dsRNA的获得与pre-miRNA319a中目的序列的替换

3.3植物表达载体的构建

3.3.1植物表达载体的PCR鉴定

3.3.2植物重组表达载体的酶切鉴定

3.4 sRNA对靶基因的剪切效率的分析

3.4.1 PVY-NIb-LUC载体构建及鉴定

3.4.2植物重组表达载体与PVY-NIb-LUC瞬时共侵染本生烟

3.5转基因烟草的获得及验证

3.5.1转基因烟草的获得

3.5.2转基因烟草PCR检测

3.6转基因烟草中sRNA的表达量检测

3.7转基因烟草抗病性分析

3.7.1 T0代转基因烟草PVY抗性鉴定

3.7.2转基因烟草Northern blot分析

3.7.3转基因烟草Southern blot分析

3.8 T1代转基因植株的遗传稳定性检测

4讨论

5结论

参考文献

致谢