中国荷斯坦牛不同泌乳阶段乳腺基因差异表达研究

摘要

泌乳曲线变化的内在分子机理长期以来一直是困扰泌乳生物学家的难题，泌乳高峰过后产奶量下降是造成奶农经济损失的重要原因。为了探究中国荷斯坦牛泌乳启动、泌乳退化、泌乳上升、泌乳下降过程乳腺内部分子控制机制及乳腺发育和泌乳更替的机理，本研究采取了处于泌乳早期、泌乳高峰期、泌乳中期、泌乳后期和干奶期五个泌乳阶段空怀奶牛的乳腺组织进行转录组测序。转录组测序技术能够对真核生物进行全面而复杂的分析，具有误差少、动态范围广、假阳性信号率低、重复率高的特点，已经成为一种全面而准确的基因表达模式的分析工具。 本研究总共获得37.98Gb的reads,其中有86.34%-88.24%的数据能够单一比对到参考基因组。通过对不同泌乳阶段乳腺转录组进行比较，筛选出差异表达基因，并应用GO富集分析、KEGG通路分析、QTL分析、蛋白互作网络分析等方法对其进行联合分析，应用荧光定量PCR和免疫组化技术对分析结果进行验证。分析结果显示，① 泌乳启动和泌乳退化过程差异表达基因大都与物质代谢与转运活动及免疫反应相关；泌乳高峰前后与细胞外基质相关的基因表达发生显著变化。②筛选出23个与泌乳相关的候选基因。③随机选取18个差异表达基因进行荧光定量PCR验证,RNA测序结果与荧光定量PCR结果呈现高相关（R2=0.866）。④对4个泌乳功能蛋白进行免疫组化验证，发现这4个蛋白在乳腺上皮细胞内表达，且蛋白表达水平与mRNA水平呈现正相关。 综上所述，泌乳曲线变化暗藏乳腺泌乳的自我调控机制。其一，在泌乳启动和退化过程中乳腺内部活动呈现相似的变化，但调节方向相反。其二，细胞外基质重塑充斥着泌乳高峰期前后乳腺内部的变化，但调节方向也是相反的。本研究的发现将为寻找新的提高泌乳量的方法提供理论基础。

目录

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缩略词索引表

1.前言

1.1 奶牛泌乳过程及泌乳机制

1.1.1 泌乳过程

1.1.2泌乳机制

1.2乳成分的形成机制

1.3奶牛泌乳功能基因组学研究

1.4影响泌乳的分子机制探究

1.5本研究的目的和意义

2.材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 动物准备及乳腺组织样品采集

2.1.2 RNA分离与质量评估

2.2 RNA-seq数据获取

2.2.1转录组文库构建及测序

2.2.2质量控制

2.2.3参考基因组序列比对

2.2.4定量基因表达水平

2.3 数据分析方法

2.3.1差异表达分析

2.3.2差异表达基因的GO和KEGG富集分析

2.3.3蛋白互作（PPI）网络分析

2.3.4荧光定量PCR验证

2.3.5免疫组化验证

3. 结果与分析

3.1转录组数据

3.2泌乳启动和退化

3.2.1 DEG和QTL数据的关联分析

3.2.2 GO聚类分析和KEGG通路分析

3.2.3泌乳启动过程乳蛋白基因及乳脂代谢基因的差异表达分析

3.3泌乳上升和下降过程

3.3.1差异表达基因分析、GO聚类分析及KEGG通路分析

3.3.2蛋白互作网络分析

3.3.3荧光定量PCR验证

3.3.4免疫组化验证

4讨论

4.1泌乳启动和泌乳退化

4.1.1乳糖、乳蛋白和乳脂的合成与物质代谢和转运活动息息相关

4.1.2与免疫应答相关基因的变化

4.1.3与产奶性状相关的候选基因的分析

4.2泌乳上升下降过程

4.2.1细胞外基质的变化

4.2.2新血管发育、细胞代谢、细胞数量与泌乳变化

4.2.3 PI3K-AKT信号通路在泌乳变化过程发挥重要作用

5 结论

参考文献

致谢