菌株CFA中阿魏酸降解途径关键酶基因及其sRNA的分离研究

摘要

酚酸（Phenolic acid）类化感物质广泛存在不同作物土壤中，而其的积累是导致植物连作障碍的主要原因之一，是农业中急需解决的问题。阿魏酸是连作黄瓜土壤中常见的酚酸类化感物质，同时也是多种植物的自毒物质。当土壤中阿魏酸等酚酸物质达到一定的浓度时，其能够使植物出现发育不良或植株死亡等现象。而Pseudomonassp.CFA是从患有严重连作障碍的黄瓜类根际土壤中分离出能降解阿魏酸的一株菌株，其能有效的降解土壤中的酚酸类物质，缓解黄瓜等植物的连作障碍。本实验在前期已筛选降解阿魏酸菌株的基础上，根据转录组数据分析推断出其代谢途径，并对转录组数据进行验证。其次对阿魏酸代谢途径中相关酶基因进行分子克隆和载体构建，研究Pseudomonas sp.CFA降解阿魏酸的的代谢途径，找出代谢途径中的关键酶基因。同时还通过分析关键酶基因下的sRNA，对其进行基因敲除，进一步研究了sRNA对其代谢途径中的影响。主要研究内容及结果如下： （1）本实验先根据测序饱和度和基因覆盖度对转录组测序质量进行了评估分析，分析表明测序质量良好；然后再根据转录组数据分析推断出Pseudomonassp.CFA降解阿魏酸的代谢途径，即Pseudomonassp.CFA能将阿魏酸降解为原儿茶酸，但不能降解至产物乙酰辅酶A。最后对转录组分析出的代谢途径进行荧光定量PCR的验证及胞内乙酰辅酶A测定，验证转录组数据的可靠性，为进一步研究酚酸的降解代谢途径奠定基础。 （2）对Pseudomonas sp.CFA菌株FA代谢途径中的相关酶基因进行基因克隆，包括F1、F3、F4、F56，成功构建过表达重组质粒，再将重组质粒通过电转化方式导入原始菌株中，经PCR验证，成功获得过表达菌株。 （3）过表达菌株降解阿魏酸速率及产物浓度的测定，寻找代谢途径中的关键酶基因。在阿魏酸代谢途径中，将过表达菌株接种于液体FA培养基中，根据过表达菌株对FA降解率的速率及产物的情况寻找代谢途径中的关键酶基因，结果显示，相比于原始菌株和对照菌株，过表达菌株PME6032-CFA-F4降解阿魏酸速率与产物浓度下降的速度最快，即为代谢途径中的关键酶基因。 （4）根据sRNA上下游同源片段启动子的位置与转录方向，判断筛选出关键酶基因下的可进行敲除sRNA，进行载体的构建、基因敲除、降解率及产物浓度的测定。筛选出关键酶基因下可进行敲除的sRNA有：S8、S39、S20、S56、S14、S11。然后对sRNA上下游基因进行基因克隆、序列拼接，成功构建基因敲除载体。然后根据同源重组的原理，敲除Pseudomonas sp.CFA的sRNA基因，成功敲除Pseudomonassp.CFA基因组中的sRNA，包括：S8、S20、S14、S11。将敲除成功的缺失突变株，接种于阿魏酸液体培养基中，结果显示，其均能加快阿魏酸的降解且能提高产物原儿茶酸的浓度，为进一步研究sRNA调控机制打下基础。

目录

声明

符号说明

1前言

1.1酚酸类化感物质的来源

1.1.1酚酸类化感物质释放途径

1.2酚酸类化感物质的作用机理

1.2.1对营养成分吸收、利用的影响

1.2.2对酶活性的影响

1.2.3对激素代谢水平的影响

1.2.4对呼吸作用和光合作用的影响

1.2.5对细胞生长和分化的影响

1.2.6对膜通透性的影响

1.2.7对蛋白质合成和核酸代谢影响

1.3连作障碍的危害及解决方法

1.3.1连作障碍的危害

1.3.2连作障碍解决方法

1.4微生物降解酚酸机理的研究

1.4.1生物降解

1.4.2酚酸代谢途径的研究进展

1.4.3酚酸降解的代谢途径相关基因的研究

1.5微生物降解酚酸的研究进展

1.6转录组测序

1.6.1转录组测序的原理

1.6.2转录组测序的应用

1.7基因敲除

1.7.1基因敲除的原理

1.7.2基因敲除的研究进展

1.8细菌中sRNA

1.8.1 sRNA种类与功能

1.8.1 sRNA的研究进展

1.9本实验的研究内容、目的及意义

1.9.1实验内容

1.9.2实验目的

1.9.3实验意义

2材料与方法

2.1材料与试剂

2.1.1载体与菌株

2.1.2培养基

2.1.3实验试剂

2.1.4实验引物

2.2实验方法

2.2.1 CFA菌株转录组测序

2.2.2实时荧光定量PCR

2.2.3胞内乙酰辅酶A提取

2.2.4目的片段扩增与载体的构建

2.2.5假单胞菌CFA感受态制备和电转化

2.2.6菌株培养的条件

2.2.7酚酸降解率和亚硝酸钠-钼酸钠比色法原儿茶酸含量测定

2.2.8 sRNA基因敲除载体的构建

2.2.9结合转移和基因敲除突变株的筛选

3结果分析

3.1转录组数据质量评估

3.1.1测序饱和度分析

3.1.2基因覆盖度分析

3.2转录组数据分析

3.2.1代谢途径分析

3.2.2转录组数据可靠性验证

3.2.3胞内乙酰辅酶A测定

3.3 目的片段的扩增、载体构建及过表达菌株获得验证

3.2.1细菌DNA提取

3.2.2 目的片段的扩增

3.2.3 重组克隆质粒酶切验证

3.2.4 基因序列测序分析

3.2.5 过表达菌株的获得及验证

3.4 过表达菌株对阿魏酸降解、产物的影响及关键酶基因的确定

3.4.1 FA途径中过表达菌株对阿魏酸降解的影响

3.4.2 FA途径中过表达菌株对产物浓度的影响

3.4.3 FA途径中关键酶基因的确定

3.5 sRNA缺失突变体的构建

3.5.1上下游同源片段的扩增及序列的拼接

3.5.2同源片段拼接的T克隆的验证

3.5.3基因序列测序分析

3.5.4基因敲除载体构建

3.5.5 sRNA缺失突变株的筛选验证

3.6 缺失突变株对阿魏酸降解及产物浓度的影响

3.6.1 缺失突变株对阿魏酸降解的影响

3.6.2 FA代谢途径中缺失突变株对产物浓度的影响

4 讨论

4.1转录组数据分析验证及代谢途径的研究

4.2代谢途径中阿魏酸降解率、产物测定及限速酶基因的确定的研究

4.3 sRNA基因敲除载体构建及缺失突变株筛选验证

4.3.1 sRNA因敲除载体构建

4.3.2 sRNA缺失突变株筛选验证

4.4缺失突变株对阿魏酸降解及产物浓度的影响的研究

4.5酚酸降解菌的应用

5 结论

参考文献

致谢