HPA轴产物对猪和小鼠卵母细胞体外成熟和发育能力的影响及作用机理

摘要

应激反应激活下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴，导致下丘脑分泌促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）、垂体分泌促肾上腺皮质激素（ACTH）和肾上腺皮质分泌糖皮质激素（GCs）水平升高。卵母细胞是繁殖功能的执行者，其质量直接影响卵母细胞成熟和发育能力，但CRH、ACTH和GCs对卵母细胞成熟和发育能力影响及作用机理还知之甚少，仅有的研究表明应激生理浓度的皮质醇不影响小鼠卵母细胞的体外成熟，却显著抑制猪卵母细胞的减数分裂和体外成熟，这些互相矛盾的结果提示猪和小鼠卵母细胞对糖皮质激素敏感性存在明显不同。实验室前期工作发现CRH降低小鼠卵母细胞发育能力，但对猪卵母细胞成熟和发育能力的影响还不清楚。此外，ACTH影响斑马鱼卵母细胞的发生，还没有关于ACTH对猪和小鼠卵母细胞影响的研究。为此，在猪和小鼠卵母细胞体外成熟期间添加CRH、ACTH和GCs，研究HPA轴产物对猪和小鼠卵母细胞体外成熟和发育能力的影响及作用机理，以期为应激损伤卵母细胞发育能力的机理提供理论依据。实验结果如下： （1）培养液中添加不同剂量的GCs，比较其对猪和小鼠卵母细胞体外成熟的影响，结果显示，0.25μg/mL的皮质醇可抑制猪COCs（卵丘卵母细胞复合体）的体外成熟，50μg/mL皮质醇或皮质酮才能抑制小鼠COCs的成熟，说明猪和小鼠卵母细胞对GCs的敏感性差别很大；100μg/mL的皮质醇处理猪DOs（裸卵）可抑制其体外成熟，与COC相比皮质醇添加浓度较高，说明卵丘细胞参与GCs对其卵母细胞成熟的调控； （2）利用免疫荧光的方法检测猪和小鼠DOs及CCs（卵丘细胞）NR3C1（糖皮质激素受体）的表达，结果显示，猪和小鼠DOs和CCs均表达NR3C1且分布一致，说明NR3C1不是猪和小鼠卵母细胞对GCs敏感性不同的原因；此外，卵母细胞体外成熟过程中同时添加皮质醇和RU486（NR3C1抑制剂），结果显示，RU486可解除皮质醇对猪卵母细胞成熟的抑制，但对小鼠卵母细胞没有作用，说明猪卵母细胞中皮质醇通过与NR3C1结合发挥作用，而小鼠卵母细胞中皮质醇的作用与NR3C1无关； （3）利用荧光定量PCR方法检测COCs中HSD11B（11β羟基类固醇脱氢酶）mRNA的表达水平，结果显示，猪COCs的HSD11B1的表达量显著高于HSD11B2，而小鼠COCs中只表达HSD11B2；猪DOs主要表达HSD11B2，小鼠DOs只表达HSD11B2，说明猪卵母细胞中糖皮质激素的活性主要受HSD11B1调控，而小鼠中为HSD11B2； （4）猪和小鼠COCs体外培养过程中同时添加皮质醇和18β-甘草次酸（HSD11B2抑制剂）观察成熟率，结果显示，抑制HSD11B2后低浓度皮质醇就会影响其成熟，说明猪和小鼠卵母细胞中均存在HSD11B2；猪和小鼠COCs体外成熟培养过程中同时添加皮质醇和BVT2733（HSD11B1抑制剂），结果显示，抑制HSD11B1后则皮质醇不影响其体外成熟，小鼠COCs体外成熟时抑制HSD11B1对结果没有影响，说明猪卵母细胞中存在HSD11B1且发挥作用，小鼠卵母细胞中不存在HSD11B1； （5）通过检测条件培养基中皮质醇和可的松的转变，进一步证明猪卵母细胞的HSD11B1活性较强，小鼠卵母细胞仅有HSD11B2活性表达； （6）培养液中添加不同剂量的ACTH，比较其对猪和小鼠卵母细胞体外成熟及发育能力的影响，结果显示，ACTH影响猪卵母细胞的体外成熟和发育能力，但对小鼠无影响；利用免疫荧光的方法检测猪和小鼠DOs及CCs中MC2R（ACTH受体）的表达，结果显示，在猪和小鼠的DOs及CCs中均检测到MC2R的表达，MC2R主要分布在猪DOs的细胞膜上，而小鼠主要分布在DOs的细胞质和核仁中，说明MC2R分布位置决定ACTH对卵母细胞成熟和发育的作用； （7）培养液中添加不同剂量的CRH，比较其对猪和小鼠卵母细胞体外成熟及发育能力的影响，结果显示，CRH降低猪和小鼠卵母细胞的囊胚率；利用免疫荧光的方法检测猪和小鼠DOs及CCs中CRHR1（CRH受体）的表达，在猪和小鼠的DOs及CCs中均检测到CRHR1的表达，说明CRH通过与CRHR1结合发挥作用。 总之，猪和小鼠卵母细胞HSD11B1和HSD11B2的表达比例不同，导致其对GCs的敏感性不同，此外，皮质醇通过结合NR3C1抑制猪卵母细胞成熟，而GCs对小鼠卵母细胞成熟的抑制作用并不通过NR3C1。ACTH影响猪卵母细胞的体外成熟和发育能力，但对小鼠无影响。CRH会影响猪和小鼠卵母细胞的发育能力。

目录

声明

符号说明

1前言

1.1应激

1.1.1应激的概念与发展

1.1.2应激与雌性生殖

1.2 HPA轴

1.2.1 HPA轴的产物与功能

1.2.2 HPA轴与应激

1.3卵母细胞的成熟

1.3.1细胞核成熟

1.3.2细胞质成熟

1.4 CRH与雌性生殖

1.4.1 CRH的结构特征与生理功能

1.4.2 CRH与应激

1.4.3 CRH对雌性生殖系统的调控

1.5 ACTH与雌性生殖

1.5.1 ACTH的结构特征与生理功能

1.5.2 ACTH与应激

1.5.3 ACTH对雌性生殖系统的调控

1.6糖皮质激素与雌性生殖

1.6.1糖皮质激素的信号通路及生理功能

1.6.2糖皮质激素在血清中的浓度

1.6.3糖皮质激素对雌性生殖系统的调控

1.6.4糖皮质激素与HSD11B的关系

1.7本研究的主要内容和目的意义

2材料与方法

2.1实验材料

2.1.1主要仪器设备

2.1.2主要试剂及配制

2.2实验方法

2.2.1小鼠饲养及超排处理

2.2.2卵母细胞的获取

2.2.3卵母细胞的体外成熟

2.2.4卵母细胞激活

2.2.5胚胎培养

2.2.6大鼠肾上腺获取及肾上腺皮质细胞培养

2.2.7荧光定量检测猪和小鼠卵母细胞HSD11B基因mRNA含量的变化

2.2.8 GV期卵母细胞NR3C1、MC2R和CRHR1的免疫荧光染色

2.2.9卵丘细胞NR3C1、MC2R和CRHR1的免疫荧光染色

2.2.10检测皮质醇-可的松的相互转变

2.2.11皮质醇检测方法

2.3数据分析

3结果与分析

3.1 GCs对猪和小鼠卵母细胞体外成熟能力的影响及作用机理

3.1.1皮质醇对猪COCs中卵母细胞体外成熟的影响

3.1.2 GCs对小鼠COCs中卵母细胞体外成熟的影响

3.1.3皮质醇对猪DOs体外成熟的影响

3.1.4皮质醇对小鼠DOs体外成熟的影响

3.1.5猪和小鼠卵母细胞对GCs敏感性不同与培养基无关

3.1.6皮质醇通过NR3C1抑制猪卵母细胞成熟

3.1.7 皮质醇不通过NR3C1抑制小鼠卵母细胞成熟

3.1.8猪卵母细胞及卵丘细胞NR3C1的表达

3.1.9小鼠卵母细胞及卵丘细胞NR3C1的表达

3.1.10猪卵母细胞中HSD11B的mRNA表达

3.1.11小鼠卵母细胞中HSD11B的mRNA表达

3.1.12小鼠HSD11B1引物的有效性

3.1.13抑制猪卵母细胞HSD11B1或HSD11B2对其成熟率的影响

3.1.14抑制小鼠卵母细胞HSD11B1或HSD11B2对其成熟率的影响

3.1.15猪卵母细胞体外成熟过程中皮质醇和可的松的相互转化

3.1.16小鼠卵母细胞体外成熟过程中皮质醇和可的松的相互转化

3.1.17小鼠卵母细胞对GC的敏感性主要与HSD11B2有关

3.2 ACTH对猪和小鼠卵母细胞体外成熟及发育能力的影响

3.2.1 ACTH药品活性检测

3.2.2 ACTH对猪卵母细胞成熟及发育能力的影响

3.2.3 ACTH小鼠卵母细胞成熟及发育能力的影响

3.2.4猪卵母细胞和卵丘细胞中MC2R的表达

3.2.5小鼠卵母细胞和卵丘细胞中MC2R的表达

3.3 CRH对猪和小鼠卵母细胞体外成熟及发育能力的影响

3.3.1 CRH对猪卵母细胞成熟及发育能力的影响

3.3.3 CRH对小鼠卵母细胞成熟及发育能力的影响

3.3.2猪卵母细胞和卵丘细胞中CRHR1的表达

3.3.4小鼠卵母细胞和卵丘细胞中CRHR1的表达

4讨论

4.1成熟培养液与卵母细胞对糖皮质激素敏感性的关系

4.2血清和卵泡液中糖皮质激素的浓度

4.3卵母细胞对糖皮质激素的敏感性

4.4糖皮质激素的作用途径

4.5糖皮质激素活性转变与HSD11B的关系

4.6猪DOs与CCs对糖皮质激素活性的调控

4.7 ACTH对卵母细胞的影响

4.8猪与小鼠卵母细胞MC2R分布位置对其功能的影响

4.9 CRH对卵母细胞发育能力的的影响

5结论

参考文献

致谢

攻读学位期间发表论文情况

附录