设施蔬菜产区及其周边环境水中烟草花叶病毒属病毒的检测与鉴定

摘要

环境水中存在大量的植物病毒，环境水作为病毒传播的途径，在病害的发生、蔓延过程中具有潜在的威胁。本研究主要对设施蔬菜产区及周边环境水样进行检测，通过接种试验证明环境水中植物病毒的侵染性，以验证其进入病害循环的可能性。本研究的主要结果如下： 1.对山东、江苏、河北、上海等地采集到的79份水样进行浓缩提纯、核酸提取、RT-PCR等一系列操作后，共检测出烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus,TMV）、黄瓜绿斑驳花叶病毒（Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV）、辣椒轻斑驳病毒（Pepper mild mottle virus,PMMoV）、番茄斑驳花叶病毒（Tomato mottle mosaic virus,ToMMV）4种植物病毒。在总样品中，有29份水样中检测出有植物病毒的存在，总检出率达36.7%。其中有22份水样中检测出CGMMV，检出率为27.8%；有7份样品中检测出PMMoV，检出率为8.9%；有2份样品中检测出TMV，检出率为2.5%；仅1份样品中检测出ToMMV，检出率为1.3%。 2.不同地区植物病毒分布状况不同：在山东济南检测出CGMMV和ToMMV，在山东潍坊和临沂均检测出CGMMV和PMMoV；在河北大城检测到PMMoV和TMV；在山东菏泽检测到CGMMV和TMV；在山东泰安、聊城及江苏赣榆检测到CGMMV；在山东烟台、上海地区检测到PMMoV；在山东淄博地区没有检测到植物病毒。 3.将浓缩得到的TMV、CGMMV、PMMoV浓缩液接种到烟草上，植株发病，说明水中植物病毒具有侵染性。 4.将各地区得到的TMV、CGMMV、PMMoV分离物进行一致性分析并构建系统发育树。 结果显示：TMV-HZ（MG763753）分离物与塞尔维亚40-11（KF184654）分离物的亲缘关系最近；TMV-HB（MG763752）分离物与中国云南HHGJ（KC572632）分离物亲缘关系最近；SDLY-FX（MG729801）分离物与山东泰安SDTA-2（MG729806）分离物亲缘关系最近；SDLC-3（MG729804）分离物与中国河南pXT1-CGMMV（KY753929）分离物亲缘关系最近；SDHZ-WL（MG729807）分离物、SDQZ-3（MG729805）分离物、江苏JS-4（MG729802）分离物与山东泰安SD Luffa（KJ754196）分离物亲缘关系较近；SHSJ2（MG729813）分离物与中国重庆PMMoV-CQ（KP955400）分离物亲缘关系最近；SDYT-ZY（MG729814）分离物与河北大城HBDC（MG729809）分离物亲缘关系最近；SDFX（MG729810）分离物、上海宝山SHBS-2（MG729808）分离物与山东SD60（KR261606）分离物亲缘关系较近；SDQZ5（MG729812）分离物、SHMH-4（MG729811）分离物与西班牙P95/25（FR671386）分离物亲缘关系较近。研究结果表明，植物病毒在环境水中有传播扩散的趋势。

目录

声明

符号说明

1 前言

1.1 环境水中植物病毒的简介

1.1.1 环境水中植物病毒的来源

1.1.2 环境水中植物病毒的介体

1.1.3 环境水中植物病毒的制约条件

1.1.4 环境水中植物病毒的传播

1.1.5 环境水中植物病毒的灭活处理

1.2 环境水中病毒浓缩方法

1.2.1 膜吸附洗脱法

1.2.2 超滤法

1.2.3 免疫磁珠捕获法

1.2.4 差速离心法

1.2.5 聚乙二醇沉淀法

1.3 环境水中部分植物病毒的简介

1.3.1 烟草花叶病毒简介

1.3.2 黄瓜绿斑驳花叶病毒简介

1.3.3 辣椒轻斑驳斑病毒简介

1.4 本研究的目的与意义

2 材料与方法

2.1 实验材料与仪器

2.1.1 样品采集

2.1.2 菌株、分子生物学及生化试剂

2.1.3 主要试验仪器

2.1.4 实验试剂的配制方法

2.2 环境水中植物病毒的鉴定及检测

2.2.1 环境水中植物病毒的浓缩方法

2.2.2 植物病毒粒子DNA/RNA共提取

2.2.3 引物的设计与合成

2.2.4 反转录cDNA的合成

2.2.5 PCR扩增

2.2.6 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测

2.2.7 目的片段切胶回收

2.2.8 回收产物与载体连接

2.2.9 大肠杆菌感受态细胞的制备

2.2.10 连接产物转化至大肠杆菌DH5α

2.2.11 PCR方法鉴定阳性单菌落

2.2.12 序列测定分析

2.3 环境水中植物病毒接种鉴定

2.3.1接种烟草发病植株总RNA的提取

2.3.2 引物设计与合成

2.3.3 反转录cDNA的合成

2.3.4 PCR 扩增

2.3.5 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测

2.3.6 目的片段的切胶回收

2.3.7 回收产物与载体连接

2.3.8 连接产物转化至大肠杆菌

2.3.9 PCR方法鉴定阳性单菌落

2.3.10 序列测定分析

3 结果与分析

3.1 环境水中植物病毒病病原的检测

3.1.1 环境水中植物病毒病原种类的鉴定

3.1.2 不同地区环境水中植物病毒的检出类型

3.1.3 环境水中植物病毒检出率

3.1.4 本研究CGMMV的检出率

3.2 烟草花叶病毒的接种鉴定与分析

3.2.1 TMV接种检测及鉴定

3.2.2 序列一致性分析

3.2.3 系统进化树分析

3.3 黄瓜绿斑驳花叶病毒的接种鉴定与分析

3.3.1 CGMMV接种检测及鉴定

3.3.2 序列一致性分析

3.3.3 系统进化树分析

3.4 辣椒轻斑驳病毒的接种鉴定与分析

3.4.1 PMMoV接种检测及鉴定

3.4.2 序列一致性分析

3.4.3 系统进化树分析

4 讨论

4.1 环境水中植物病毒的检测

4.2 环境水中TMV、CGMMV和PMMoV浓缩液的接种鉴定

4.3 构建TMV、CGMMV和PMMoV系统进化树分析

5 结论

参考文献

致谢