辣椒烟草花叶病毒的分子鉴定及检测技术研究

摘要

辣椒系茄科辣椒属一年或有限多年生草本植物，其营养价值极高，堪称―蔬菜之冠。作为辣椒产销大省，贵州辣椒常年栽培面积500万亩左右，约占中国的20％，产值150亿左右，其经济对辣椒产业的依赖程度有上升之势。然而，近年来随着辣椒种质的交流，病毒随之扩散，并产生越来越严重的危害，造成极大的经济损失。因此，对辣椒病毒病的早期诊断并采取一定的防范措施对减少经济损失具有重要意义。烟草花叶病毒(Tobacco Mosaic Virus，TMV)隶属于烟草花叶属（Tobamovirus），为(+)ssRNA病毒，主要通过汁液传播，病健叶轻微摩擦造成微伤口，病毒即可侵入，对辣椒的危害日益扩大。对植物病毒分离物进行分子鉴定并研究开发出快速灵敏的检测方法对病毒病的早期预防具有重要的理论及实践意义。本研究对采自贵州的辣椒病样进行了ELISA检测，对TMV贵州辣椒分离物（TMV-GZ）进行了分子鉴定，建立了同步检测TMV、PMMoV和CMV三种辣椒重要病毒的多重RT-PCR方法和检测TMV的核酸斑点杂交方法，同时，建立并优化了TMV外壳蛋白（CP）基因的原核表达体系，以期为TMV抗血清的制备及免疫学检测方法的建立奠定基础。本研究获得的主要结论如下：
　　1．成功克隆了TMV-GZ分离物全长CP基因序列，该基因长为480 bp，编码18 kDa的CP蛋白。TMV-GZ分离物CP基因序列与同属异种病毒的同源性仅为32%-65%，序列差异明显；相反，它与11个TMV病毒分离物的同源性在98%-99%之间；TMV及其它病毒分离物聚类形成3个明显分支，TMV-GZ与其他11个TMV分离物亲缘关系较近，而与同属其他3种病毒之间的进化距离较远，证实该分离物确为TMV。
　　2．根据烟草花叶病毒(TMV)、辣椒轻斑驳病毒(PMMoV)和黄瓜花叶病毒(CMV)的外壳蛋白(CP)编码序列设计了3对PCR检测引物，通过条件优化建立了同步检测以上3种辣椒病毒的多重RT-PCR方法。该多重 RT-PCR体系不对ORSV、PVX和PVY等同属或不同属的其它病毒发生反应，特异性好；可检测到104×稀释的病毒cDNA模板，具有较高的灵敏度，可用于PMMoV、TMV和CMV3种辣椒病毒的同步检测。
　　3.基于TMV的CP序列，采用随机引物法制备了地高辛标记的TMV双链cDNA杂交探针（DIG-TMV CP），并初步建立了快速检测TMV的核酸斑点杂交（NASH）方法，该法具有较好的特异性和灵敏度（可检测到625×稀释的病毒RNA）。
　　4.构建了TMV CP基因的原核表达载体pET32a_TMV CP。该CP基因以融合蛋白的形式获得了可溶性高效表达。优化后的原核表达条件为：0.8 mM IPTG诱导、25℃、200 rpm和9h。以重组的融合CP蛋白免疫小白鼠制备了TMV抗血清。

目录

缩 略 词

第一章 综 述

1.1 辣椒产业的发展状况

1.2 辣椒病毒病

1.3 病毒病检测方法

1.4 本研究意义

1.5 研究内容

第二章 材料与方法

2.1 感病样本采集及ELISA检测

2.2 毒原的分离保存

2.3 TMV分离物CP基因克隆

2.4 TMV CP基因表达载体的构建

2.5 TMV CP基因的原核表达

2.6 抗原制备

2.6免疫及抗血清制备

2.7 TMV, PMMoV和CMV的三重RT-PCR检测技术

2.8 TMV 的核酸斑点杂交（NASH）检测技术

第三章 结果与分析

3.1 贵阳周边辣椒病毒病初步调查

3.2 TMV毒原的分离保存

3.3 TMV-GZ的分子鉴定

3.4 TMV CP基因的原核表达

3.5 TMV重组CP蛋白抗血清的制备

3.6辣椒三种病毒的多重RT-PCR同步检测

3.7 TMV的核酸斑点杂交（NASH）检测技术研究

第四章 讨 论

4.1 辣椒病毒病调查

4.2 TMV的分子鉴定

4.3 抗血清制备

4.4三种辣椒病毒的多重RT-PCR同步检测

4.5 TMV的核酸斑点杂交（NASH）检测

参考文献

攻读硕士研究生期间发表的文章

附录A 仪器设备

附录B 常用试剂及缓冲液配置

附录C所用的pET32a(+)原核表达载体(Novagen公司)

致谢

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