鸡卵泡选择与发育过程中Wnt4的功能、转录调控及相关基因的表达分析

摘要

卵巢卵泡选择是一个重要的生物学过程,与鸡的产蛋性能和繁殖力高度相关.卵泡选择主要依赖于来自垂体FSH的调控以及卵泡FSHR的表达.在规律产蛋的母鸡中,具有最高FSHR表达量的小黄卵泡将被选择进入等级卵泡,快速生长发育直至排卵.对鸡卵泡选择分子机制的研究,有助于鉴定鸡及其它家禽产蛋性状的关键基因,能够为有效的开发利用卵巢内的卵泡资源,提高鸡的产蛋和繁殖性能提供理论依据.为了揭示鸡卵泡选择的分子机制,本研究对FSHR表达量最高和最低的两组小黄卵泡进行了转录组测序,通过比较FSHR不同表达水平小黄卵泡的差异表达基因,探索与卵泡选择有关的基因,分析其在鸡卵泡选择中的功能并阐述其转录调控机制.结果如下: (1)鸡小黄卵泡的转录组测序.转录组测序共检测了六个小黄卵泡,其中T1、T2、T3为FSHR表达量低的卵泡,T4、T5、T6为FSHR表达量高的卵泡,共检测了17993个基因,T1/T4中获得1968个差异基因,561个上调基因,1407个下调基因;T2/T5中获得289个差异基因,104个上调基因,185个下调基因;T3/T6中获得590个差异基因,225个上调基因,365个下调基因,三组共有的差异基因为40个,能够注释到NCBI上的为35个.GO分析表明差异基因在细胞组分中的主要分类为细胞组分,细胞、细胞器、膜.分子功能主要分为结合和催化活性.生物学过程主要包括细胞过程、单一生物过程、生物学调节和代谢过程.差异基因参与多种生物学功能,如激素代谢过程、类固醇代谢过程、性腺发育、繁殖过程的调控、细胞增殖、蛋白磷酸化以及血管发生等,其中Wnt4参与大部分的生物过程.对检测到的DEGs进行KEGG通路富集分析,发现随着FSHR表达量差异的增大,显著富集到的KEGG通路的数量也逐渐增加,其中在T1/T4组,显著富集到了如TGF-βsignaling pathway、MAPK signaling pathway、Wnt signaling pathway等与卵泡发育密切相关的信号通路.对Wnt signaling pathway中显著富集到的多个DEGs的分析发现,Wnt4在FSHR表达量高的卵泡中高表达,显著高于FSHR表达量低的卵泡,差异倍数高达4.23.为了预测与卵泡选择相关的关键候选基因,从测序所得的差异基因中,筛选出来一批共有差异基因,进行了蛋白网络互作分析,成功构建了由122个基因与185对互作关系构成的蛋白互作网络,结果发现如Smad2、Wnt4和FSHR等基因在互作网络中处于重要的调控位置.进一步的网络模块分析揭示出3个节点为关键调控基因,依次为Gnao1,Smad2,Wnt4.并对关键差异基因进行了GO功能注释.从测序结果中挑选十个基因进行了qRT-PCR验证,表达趋势与测序结果基本一致.综合上面的分析结果,推测Wnt4可能在卵泡选择和发育过程中起着重要的调控作用,接下来对Wnt4的功能进行了系统的研究. (2)Wnt4在鸡卵泡中的表达特征.Wnt4属于Wnt家族的成员,是一种分泌型的糖蛋白.Wnt家族成员在哺乳动物卵泡发育中起到很重要的调控作用,但对于禽类卵泡发育的研究还相对较少.本研究首先对Wnt4在鸡卵泡发育过程中的表达进行了检测,发现Wnt4mRNA在等级前卵泡中的表达水平较高,显著高于等级卵泡,尤其在6-8mm小黄卵泡中的表达水平最高,其mRNA和蛋白表达在排卵前后都处于一个较低的水平.Wnt4在鸡卵泡颗粒细胞中的表达量显著高于膜细胞,主要在鸡等级前卵泡颗粒细胞中表达. (3)鸡Wnt4的功能及表达调控.Wnt4能够刺激卵泡颗粒细胞的增殖,上调卵泡中StAR和CYP11A1类固醇激素合成基因的表达,上调FSHR的表达并下调AMH和OCLN的表达,说明Wnt4在卵泡选择和发育过程中起到一定的调控作用.FSH能够显著上调鸡卵泡颗粒细胞中Wnt4mRNA和蛋白的表达.在卵泡选择前后,Wnt4对于FSH效应的影响有一定的不同,在等级卵泡颗粒细胞中,Wnt4能够增强FSH对于孕酮合成和类固醇激素生成相关基因表达的促进作用,但在鸡等级前卵泡颗粒细胞中,Wnt4却抑制FSH的促进作用. (4)IWR-1对FSHR、StAR和CYP11A1表达的影响.Wnt经典信号通路对于类固醇基因表达至关重要,IWR-1是经典Wnt信号通路的抑制剂,当Wnt经典信号通路被抑制后,StAR和CYP11A1表达量降低,同时FSH的促进作用也受到了抑制,这种抑制作用当过表达Wnt4后出现了缓解. (5)鸡Wnt4转录关键调控区的鉴定.Wnt4启动子区-3354至-2689为关键调控区域,能够响应FSH的刺激,其中-3015(G＞C)位点有可能是转录因子NFAT5的结合位点,通过响应FSH的应答调控Wnt4基因的转录. (6)其它参与Wnt信号通路基因在卵泡中的表达情况及作用分析.Axin2、Fzd1、WIF1以及Wnt9a均在6-8mm的小黄卵泡中表达量最高,显著高于其他等级卵泡;Wnt5a在F1中有较高水平的表达;CTNNB1的表达量在各等级卵泡中没有明显差异,在排卵后卵泡中出现显著的下降.Wnt5a能够显著上调FSHR的表达,WIF1则能显著下调FSHR的表达并上调StAR的表达. 综上所述,本文研究了FSHR不同表达水平的小黄卵泡中基因表达的变化,分析了卵泡选择过程中差异表达的基因,并对Wnt4在卵泡选择发育过程中的作用以及其它参与Wnt信号通路基因在卵泡中的表达情况及作用进行了深入的探讨.本研究可为提高鸡的产蛋性能提供理论依据,为进一步阐明哺乳动物卵泡选择的分子机制提供参考.

目录

声明

符 号 说 明

1前 言

1.1鸡繁殖特点

1.1.1鸡卵巢形态及发育

1.1.2 鸡卵泡发育

1.1.3 卵泡选择

1.1.4 影响卵泡选择和发育的因素

1.2 Wnt信号通路

1.2.1 Wnt信号通路简介

1.2.2 Wnt家族成员在卵泡发育中的作用

1.2.3 激素对Wnt家族基因表达的调控作用

1.2.4 负反馈调节Wnt/β-catenin信号通路

1.3 转录组测序技术及其应用

1.3.1 转录组测序技术的发展

1.3.2 转录组测序技术的应用

1.4 本研究的目的及意义

2材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1实验动物与样品采集

2.1.2 实验设计

2.1.3 主要仪器设备

2.1.4主要试剂及来源

2.1.5常用试剂的配置

2.1.6 分子生物学数据库及软件

2.2 实验方法

2.2.1 RNA-seq

2.2.2 相关质粒的构建

2.2.3 鸡卵泡颗粒细胞和膜细胞的分离培养

2.2.4 质粒转染细胞

2.2.5 细胞RNA的提取

2.2.6 Western Blot

2.2.7 ELISA

2.2.8 CCK8细胞增殖检测

2.2.9 孕酮放射免疫测定

2.2.10 双荧光素酶活性检测

2.3 数据统计分析

3结果与分析

3.1 不同FSHR表达水平小黄卵泡的转录组分析

3.1.1 qRT-PCR检测小黄卵泡中FSHR的表达水平

3.1.2 转录组测序数据统计与评估

3.1.3 与参考基因组比对统计

3.1.4 基因结构分析

3.1.5不同样品表达量比对

3.1.6 差异表达基因分析

3.1.7基因功能注释

3.1.8 差异表达基因互作分析

3.1.9 qRT-PCR检测差异表达基因

3.2 Wnt4的表达特征

3.2.1 Wnt4在不同等级卵泡中的表达情况

3.2.2 Wnt4在不同细胞中的表达情况

3.3 Wnt4对鸡卵泡发育的调控作用

3.3.1 Wnt4对鸡等级前卵泡颗粒细胞类固醇激素合成基因的作用

3.3.2 Wnt4对鸡等级卵泡颗粒细胞类固醇激素合成基因的作用

3.3.3 Wnt4对鸡卵泡颗粒细胞增殖的作用

3.4 Wnt4对卵泡选择的调节作用

3.5 FSH与Wnt4的调控关系

3.5.1 FSH对Wnt4表达的调控作用

3.5.2 Wnt4与FSH效应的相互影响

3.6 Wnt4启动子区分析

3.6.1构建启动子删除片段

3.6.2 Wnt4关键启动子区鉴定

3.6.3 Wnt4启动子关键调控区多态位点鉴定与转录因子预测

3.7 IWR-1对FSHR、StAR和CYP11A1表达的影响

3.7.1 IWR-1对鸡等级前卵泡颗粒细胞的影响

3.7.2 IWR-1对鸡等级卵泡颗粒细胞的影响

3.8 Wnt信号通路相关基因在鸡卵泡中的表达情况及作用分析

3.8.1 Wnt信号通路相关基因在鸡不同等级卵泡中的表达情况

3.8.2 Wnt5a对鸡卵泡颗粒细胞分化的作用

3.8.3 WIF1对鸡卵泡颗粒细胞分化的作用

4 讨 论

4.1 鸡不同FSHR表达量小黄卵泡差异表达基因的鉴定及分析

4.2 Wnt信号通路相关基因在鸡卵泡选择和发育过程中的表达调控

4.3 Wnt4对鸡卵泡颗粒细胞增殖和分化的调控作用

4.4 Wnt4对鸡卵泡选择的作用

4.5 Wnt4对FSH效应的影响

5结 论

6创 新 点

参考文献

附录

致谢

攻读博士期间发表论文情况