鸡卵泡发育相关基因和miRNA的鉴定及功能分析

摘要

动物育种实践证明，性早熟性状可以遗传，可能存在控制性早熟的主效基因，因此利用性早熟地方鸡品种筛选性早熟相关基因，可用于动物培育性早熟高繁殖力的品种以及为人类性早熟疾病的控制和治疗提供参考。动物性成熟是一个受多基因调控的复杂性状，在哺乳动物进行了大量研究，但禽类相对较少。鸡的卵泡在发育成熟过程中有严格的等级性，卵泡一旦经过选择后就按等级发育直至排卵，且很少发生闭锁。提高进入优势化等级的卵泡数量对于提高鸡的产蛋性能具有重要的经济意义。目前对鸡卵泡优势化选择及等级化维持的分子机制大多仍不清楚。哺乳动物研究表明，有多种生长因子以自分泌/旁分泌的方式在促性腺激素协同下参与了卵泡发育调控。miRNA是近年来发现的具有许多调控功能的一类非编码小分子RNA，其在哺乳动物卵巢中的表达特征已有报道，但在禽类卵巢的表达及功能研究尚未见报道。本研究对鸡卵泡发育相关基因及miRNA进行了鉴定和功能分析。
　　 一、鸡FSHR基因5’调控区-237和-868两个突变位点的多态性及功能分析
　　 促卵泡素（FSH）是调控动物繁殖活动的重要激素之一，对动物卵巢卵泡的生长、发育、分化、成熟和排卵起着必不可少的作用，其生物学功能的发挥要通过位于靶细胞膜上的促卵泡素受体（FSHR）介导，研究FSHR5’调控区突变与产蛋性能的关系，寻找繁殖相关的DNA分子标记，对于禽类育种实践将有着重要的现实意义。
　　 本研究用5个品种分析了突变位点的基因型分布，用2个鸡品种共计943个个体进行了突变位点基因型和单倍型的检测以及与产蛋性状关联分析，用实时荧光定量PCR技术对突变位点TTG+G+、TTG+G-和TTG-G-三种不同基因型间FSHR mRNA的表达量进行分析，构建4种单倍型载体，体外转染鸡的卵泡颗粒细胞，利用双荧光素酶报告基因检测系统对其启动基因表达的效率进行了分析。5个品种比较的结果表明：-868位点200 bp缺失型（G-）频率在地方品种达90％以上；文昌鸡群体单位点多态与39 w产蛋数和开产日龄相关不显著，两位点双倍型分析结果与开产日龄相关密切，TTG+G-对应较小的开产日龄（123 d），TTG+G+对应较大的开产日龄（134 d），两者差异显著（P=0.016）。新杨褐群体在-237位点为TT型时-868位点与37 w产蛋数相关显著（P<0.05）：G-型对应较早开产日龄，但G+型对应较高的后期产蛋数；荧光定量结果也表明，高峰期G+G+型FSHR mRNA的表达量最高（P<0.05）。荧光素酶的分析结果表明，AG-型的启动效率最高，显著高于TG+、TG-单倍型（P=0.015）。推测G-型可能与早开产有关，这与G-在开产较早的地方品种中的频率较高相一致，G+型与高的产蛋数有关，其在高产群体中频率较高，两位点间的作用机理还有待于进一步研究。
　　 二、TNRC6A（又称GW182）参与RNAi（RNA干扰）和miRNA途径，与mRNA、Argonaute等蛋白聚集在细胞质小体（P body或GW-body），参与转录后调控。本研究分析了TNRC6A基因在下丘脑、输卵管、肝脏及卵巢和卵泡发育不同时期的表达规律。实时荧光定量结果显示，TNRC6A mRNA在17 w自来航鸡卵巢比23 w开产后卵巢的表达量呈现下调，而在下丘脑、肝脏及输卵管中则上调表达（P<0.05）。在直径4 mm的白卵泡中表达量最高，且跟其它几级卵泡差异显著（P<0.05），在直径6-8mm的黄卵泡中表达量最低，之后随卵泡直径的增大而呈增高趋势，在排卵前最大的F1卵泡中表达量又有所下降，但从黄卵泡到F1卵泡TNRC6A mRNA表达量差异不显著。
　　 三、cDNA.-FLP技术是一种新的研究基因差异表达的技术，具有可靠性高、重复性好、假阳性率低、不需要预先知道序列信息及所需仪器设备简单等优点，而被广泛用于生物基因表达特性的研究。本研究用cDNA-AFLP方法，以具有性早熟特性的济宁百日鸡为试验材料，筛选与性早熟有关的基因。使用EcoRI和MseI双酶切组合，用54对不同的引物组合扩增出403个差异显示片段，经差异带挖取，二次扩增，胶回收纯化及克隆测序后，得到27个与GenBank数据库高度同源的差异表达序列。
　　 选择可能与繁殖有关的13个差异显示基因进行荧光定量验证，最终获得5个在表达量上有显著差异的基因，其中有4个差异基因在开产的卵巢中表达上调，功能分析发现CCT6A与孕酮的产生有关，ERCC8基因所编码的蛋白是miRNA的靶蛋白，ZNF183是一类具有锌指结构的重要转录因子，最初在爪蟾卵母细胞发现，Poly（A）polymeraseⅡ对于卵母细胞的成熟有重要作用。在开产的卵巢明显下调的LOC418883，其功能类似于酵母的vacuolar protein sorting36，下一步将对这些在性成熟前后卵巢中存在明显表达差异基因的功能进行深入探讨。
　　 四、采用Solexa测序技术分析了开产前后鸡卵巢差异表达的mRNA。采集3只42 d雏鸡和3只23 w产蛋白来航鸡的卵巢组织，混池测序，结果在开产的卵巢共筛选到差异表达的mRNA3648个，其中有2088个呈下调表达，1560个呈上调表达，对测得的差异表达基因进行分析验证，为筛选性成熟相关基因奠定基础。
　　 五、采用Solexa测序技术分析了开产前后鸡卵巢差异表达的miRNA。采集3只42d雏鸡和3只23 w产蛋白来航鸡的卵巢组织，混池测序，结果共筛选到72个差异表达miRNA，其中34个上调表达，38个下调表达。在未开产鸡的卵巢中筛选到189个新miRNA，在开产鸡的卵巢中筛选到97个新miRNA。对获得的差异表达miRNA进行分析验证，为进一步研究miRNA在鸡卵泡发育中的作用奠定基础。
　　 综上所述，我们采用候选基因的方法对鸡FSHR基因启动子区两个位点的多态性及其与开产日龄及产蛋数的关系进行了分析，对其影响该基因表达的机制进行了探讨。对FSHR和TNRC6A的表达特征进行了定量分析。用cDNA-AFLP技术获得4个开产后上调的基因和1个下调的基因。用Solexa测序技术分析了开产前后卵巢中差异表达的基因和miRNA。这些研究为揭示鸡卵泡发育关键基因奠定了基础。

目录

文摘

英文文摘

符号说明

文献综述

1 鸡卵巢、卵泡结构及发育特征

2 影响家禽性成熟的因素

3 性成熟相关基因的研究概述

4 与鸡卵泡发育有关的调节因素

5 关于小RNA

6 关于基因差异表达研究技术

7 本研究的目的意义

材料与方法

1 试验材料

2 试验方法

第一部分 鸡FSHR 5'调控区两个突变位点的多态性与功能分析

引言

试验一 鸡FSHR 5'调控区两个突变位点与产蛋性能关联分析

1 试验材料

2 试验方法

3 试验结果

试验二 鸡FSHR 5'调控区突变位点单倍型对调控基因表达的影响

1 试验材料

2 试验方法

3 试验结果

试验三 鸡FSHR 5'调控区突变基因型对卵泡FSHR mRNA水平的影响

1 试验材料

2 试验方法

3 试验结果

讨论

小结

第二部分 鸡FSHR和TNRC6A基因的表达分析

引言

1 试验材料

2 试验方法

2.1 组织总RNA的提取

2.2 反转录

2.3 半定量RT-PCR分析TNRC6A在17 w和23 w卵巢表达

2.4 荧光定量分析TNRC6A在开产前后不同组织的表达

2.5 荧光定量分析鸡FSHR在各级卵泡的表达

2.6 统计分析

3 试验结果

3.1 TNRC6A在17 w和23 w卵巢表达半定量结果

3.2 TNRC6A在17 w和23 w不同组织表达

3.3 TNRC6A mRNA在23 w白来航各级卵泡的表达

3.4 鸡FSHR mRNA在23 w白来航各级卵泡的表达

3.5 鸡FSHR、TNRC6A mRNA在各级卵泡的表达比较

4 讨论

5 小结

第三部分 用cDNA-AFLP筛选鸡卵巢性成熟差异表达基因

引言

1 试验材料

2 试验方法

2.1 组织总RNA提取及DNase Ⅰ处理

2.2 cDNA-AFLP分析

2.3 荧光定量RT-PCR验证差异带

2.4 统计分析

3 试验结果

3.1 总RNA提取结果

3.2 DNase Ⅰ去DNA污染结果

3.3 预扩增和选择性扩增结果

3.4 差异带回收和二次扩增结果

3.5 差异表达片段克隆测序结果

3.6 基因差异表达片段同源比较

3.7 荧光定量PCR验证差异表达基因

4 讨论

5 小结

第四部分 鸡开产前后卵巢差异表达mRNA的分析

引言

1 试验材料

2 试验方法

2.1 卵巢组织总RNA的提取

2.2 表达谱分析

3 试验结果

3.1 提取的总RNA

3.2 表达谱分析结果

4 讨论

5 小结

第五部分 鸡开产前后卵巢差异表达miRNA的分析

引言

1 试验材料

2 试验方法

2.1 差异表达miRNA的筛选

2.2 小RNA的提取

3 试验结果

3.1 小RNA提取

3.2 Solexa测序分析

4 讨论

5 小结

结论

参考文献

致谢

博士期间发表论文情况