鸡ANXA2基因关键启动子区SNPs的鉴定及其与产蛋性状的关联分析

摘要

Annexin A2（膜联蛋白A2,ANXA2）是一种多功能的钙离子依赖性膜磷脂结合蛋白家族A亚族的成员，该家族中的每个成员都有一个保守的羧基结构域。研究发现，ANXA2基因在开产鸡卵巢中的表达量显著高于未开产的鸡，ANXA2mRNA在高产蛋鸡品种中的表达量显著高于低产蛋鸡品种，且在等级卵泡膜细胞中高表达。表明ANXA2基因在鸡排卵过程中发挥作用。但关于鸡ANXA2基因的多态性及其与产蛋性状的关联性还不明确。 本研究通过直接PCR扩增和单克隆测序发现鸡ANXA2基因5′端关键调控区（-2861bp至-1394bp）在高低产蛋鸡品种间存在6个SNPs，分别为g.-2337GT＞-、g.-2255C＞T、g.-2248A＞G、g.-2188A＞G、g.-2169G＞A、g.-2160A＞C。分析了六个多态位点在新杨褐、隐性白洛克鸡、文昌鸡和汶上芦花鸡四个品种中的群体分布特征，发现除新杨褐这一高度选育的商品鸡外，其它三个品种群体内的基因型分布符合哈代温伯格平衡定律。对隐性白洛克鸡（525只）群体的六个多态位点与产蛋性状的关联进行了分析，发现g.-2255位点与E32的相关性不显著（P=0.051），与AFE显著相关（P＜0.05）；g.-2188位点与这两个产蛋性状均显著相关；g.-2169位点与E32显著相关，与AFE极显著相关（P＜0.01）。GG-2188基因型个体对应着更多的32周产蛋数（32.243个），GG-2169基因型个体对应着较早的开产日龄（155.577天）。 隐性白洛克鸡群体内连锁不平衡的三个SNPs构建的优势单倍型有CAA、TGG、CAG；纯合型CAA/CAA、TGG/TGG和杂合型CAA/TGG为优势双倍型。双倍型与产蛋性状关联分析发现双倍型TGG/TGG个体对应着更多32周产蛋数（32.16个）；双倍型CAG/TGG个体对应着更早的开产日龄（155.43天）。推测对隐性白洛克鸡产蛋数和开产日龄起主要作用的是多态位点g.-2255、g.-2188和g.-2169。 以ANXA2启动子-2283bp至-1563bp区段的纯合野生型CAAGA/CAAGA的启动子质粒载体为模板，构建突变载体并转染至等级卵泡的膜细胞中，发现与野生型相比mut2-ANXA2能明显增强启动子活性。转录因子预测发现，g.-2255(T)处，可能结合转录因子BCL6；g.-2188(A)处，结合转录因子CREB；g.-2169(G)处，结合转录因子RXRF，当该位点突变成A后结合转录因子VTBP。 总之，本研究检测到鸡ANXA2基因启动子区的三个多态位点g.-2255C＞T、g.-2188A＞G、g.-2169G＞A与产蛋性状相关联；T-2255会促进ANXA2基因的表达。这些结果为进一步研究ANXA2基因的功能奠定了基础，同时也为高产蛋鸡育种提供了有效的DNA分子标记。

目录

声明

英文缩略词

1. 前 言

1.1 家禽卵巢发育及其卵泡结构

1.1.1鸡卵巢发育特征

1.1.2参与鸡卵泡选择的激素

1.1.3 卵泡发育过程中的各类细胞

1.2 ANXA2基因的生物学结构与功能

1.3 卵巢中ANXA2基因的研究进展

1.4 SNP分子标记在动物遗传育种中的作用

1.5 本研究的目的和意义

2. 材料和方法

2.1 实验材料

2.1.1 实验动物与样品采集

2.1.2 主要仪器及厂商

2.1.3 主要试剂及来源

2.1.4 常用试剂的配制

2.1.5 主要生物学应用网站及软件

2.2 试验方法

2.2.1 ANXA2基因关键启动子区的SNPs筛选

2.2.2 ANXA2基因启动子全长载体的构建

2.2.3 定点突变

2.2.4 定点突变检测转录效应

2.2.5 多态位点结合的转录因子预测

2.2.6 数据统计与分析

3. 结果与分析

3.1 ANXA2基因关键启动子区的SNPs筛选

3.1.1 基因组DNA的提取

3.1.2 ANXA2启动子区的PCR结果

3.1.3 单克隆验证

3.1.4 品种间SNPs的筛选

3.2 ANXA2基因关键启动子区SNPs在不同品种中的统计分析

3.2.1 品种内SNPs的鉴定

3.2.2 SNPs的基因型分型

3.2.3 各品种群体中SNPs的等位基因频率和基因型频率

3.3 隐性白洛克鸡群体中ANXA2关键启动子区SNPs与产蛋性状关联分析

3.3.1 隐性白洛克鸡群体中单个位点的基因型与产蛋性状的关联分析

3.3.2 隐性白洛克鸡群体中六个SNPs的连锁不平衡分析

3.3.3 三个SNPs位点的单倍型分析

3.3.4三个SNPs双倍型与产蛋性状关联分析

3.4 ANXA2基因关键启动子区的多态位点对转录活性的影响

3.4.1 ANXA2基因关键启动子区的载体构建

3.4.2 多态位点定点突变前后对转录活性的影响

3.4.3 预测SNPs位点的相关转录因子

4. 讨论

4.1 鸡ANXA2基因在卵巢卵泡中的表达规律

4.2 鸡ANXA2基因关键启动子区SNPs与产蛋性状的遗传效应

5. 结论

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的学术论文