天蚕素对凡纳滨对虾抗副溶血弧菌感染及其免疫相关基因表达的影响

摘要

凡纳滨对虾是当今世界养殖产量最高的三大对虾品种之一，养殖范围广泛。副溶血弧菌病是目前影响凡纳滨对虾养殖业最常见和爆发最频繁的一种细菌性疾病。天蚕素等抗菌肽是大多数生物抵抗病原体入侵的天然防御系统的重要组成部分，具有抵抗病原菌感染的独特生理机制，能够有效杀死病原菌且不易产生耐药性，使其成为一类极具发展潜力的生物类药物。本研究旨在探究饲料中添加天蚕素后，凡纳滨对虾对副溶血弧菌感染的抗性及其免疫相关基因表达的影响，为提高凡纳滨对虾的抗病性提供理论依据。 本研究分为体外试验和体内试验，体外试验设置处理组和对照组：处理组用不同浓度的副溶血弧菌菌液与不同浓度梯度的天蚕素溶液混合培养；对照组则用PBS代替天蚕素混合液，在37℃培养箱培养0h、4h、8h、12h后分别涂板计数，统计分析天蚕素杀灭副溶血弧菌的能力。 体内试验是将凡纳滨对虾饲养在相同的环境中，随机分为3个处理组和1个对照组，处理组分别饲喂含不同浓度梯度天蚕素的饲料，对照组饲喂基础饲料，养殖6周后，对每只虾进行处理，试验C、D、E三组及对照B组每只虾注射10μl浓度为1.0×109cfu/ml的副溶血弧菌菌液，分别在处理后0h、4h、8h、12h采集各组组织样品放于-80℃保存，用于检测免疫相关基因表达情况，同时记录各组中不同时间点死亡虾的尾数。主要研究结果如下： （1）体外试验结果显示，天蚕素通过与副溶血弧菌直接接触即可将其杀死，而且杀菌能力随着天蚕素浓度的升高而增强。 （2）体内试验结果表明，与饲喂基础饲料的B组相比，饲喂添加了天蚕素饲料的C、D、E三组中凡纳滨对虾的体重显著升高（P＜0.05）。 （3）接种副溶血弧菌之后，与饲喂基础饲料的B组相比，饲喂添加了天蚕素饲料的C、D、E三组中凡纳滨对虾死亡率显著降低（P＜0.05）。 （4）在肝胰腺组织中，感染副溶血弧菌后，Toll、IMD在添加天蚕素的C、D、E三组都有上调的趋势，在8h时Toll基因在C、D、E三组中的表达均显著高于B组（P＜0.01）；IMD基因表达量在8h时达到峰值，Crustin、Pen3和ALF均三个抗菌肽基因均上调表达。CTL、proPO和GPx在肝胰腺中的时序表达谱显示，在感染副溶血弧菌后不同时间点，3个基因表达量较对照组均显著上调（P＜0.05），在12h时表达量达到峰值。 （5）在胃组织中，D组和E组中CTL在8h、12h的表达均显著高于B组（P＜0.01），在8h和12h，GPx在E组中的表达均显著高于B组（P＜0.05）；在4h、8h、12h三个时间点，proPO在C、D、E三组中的表达均显著高于B组（P＜0.01），在8h和12h时Toll和IMD在E组中的表达均显著高于B组（P＜0.05），Crustin、Pen3、ALF三个抗菌肽基因，8h时在D组和E组中的表达均显著高于B组（P＜0.01）。 （6）在鳃组织中，在8h时CTL在D组和E组中的表达显著高于B组和C组（P＜0.01），在12h时GPx在E组中的表达显著高于D组（P＜0.05）；在8h时proPO在E组中的表达显著高于B组和C组（P＜0.05）且在8h时表达量达到最高；在8h和12h时Toll在E组中的表达显著高于B组和C组（P＜0.05）且在8h时表达量达到最高；在8h时IMD在E组中的表达显著高于B、C、D三组（P＜0.05）；在4h和8h时Crustin、Pen3、ALF三个抗菌肽基因，在E组中表达显著高于B组（P＜0.01）。 （7）在肌肉组织中，在8h时CTL、GPx、proPO三个基因在E组中的表达均显著高于B组（P＜0.05）；在4h时Toll和IMD在E组中的表达显著高于B组（P＜0.05）；在12h时Crustin、Pen3两个抗菌肽基因，在E组中表达显著高于B组（P＜0.01）。ALF基因的表达从4h到12h均呈现上升趋势，在4h和8h时ALF在D组和E组中表达显著高于B组（P＜0.01）。 综上所述，体外试验表明，天蚕素能够直接杀死副溶血弧菌，而且天蚕素的杀菌能力随着抗菌肽浓度的升高而增强。饲料中添加天蚕素能显著提高凡纳滨对虾的生长速度和成活率，而且当添加浓度为150mg/kg时，对凡纳滨对虾具有明显的促生长作用。天蚕素能使Toll和IMD的表达上调，进而激活Toll和IMD通路，使抗菌肽基因Crustin、Pen3、ALF表达出现上调。天蚕素可以增强免疫相关基因的表达，进而提高凡纳滨对虾抗副溶血弧菌感染的免疫应答能力。副溶血弧菌感染8h后，机体免疫反应最为强烈，各个免疫相关基因表达比较活跃。 本研究结果为凡纳滨对虾养殖中副溶血弧菌病的控制、凡纳滨对虾养殖业的可持续发展以及提高凡纳滨对虾对副溶血弧菌感染的遗传抗性提供了理论基础和科学依据。

目录

声明

符号说明

1前言

1.1副溶血弧菌研究进展

1.1.1副溶血弧菌的生物特性

1.1.2副溶血弧菌的主要分布及易感时期

1.1.3副溶血弧菌与人类健康

1.2凡纳滨对虾养殖业发展现状

1.2.1凡纳滨对虾的形态特征

1.2.2凡纳滨对虾的生活习性

1.2.3凡纳滨对虾的养殖状况

1.3凡纳滨对虾的免疫系统

1.3.1免疫缺陷因子（IMD）

1.3.2 Toll

1.4抗菌肽研究进展

1.4.1对虾肽Penaeidins研究进展

1.4.2抗菌蛋白Crustin

1.4.3抗脂多糖分子ALF

1.5免疫相关基因研究进展

1.5.1 C型凝集素CTL

1.5.2谷胱甘肽过氧化物酶GPx

1.5.3酚氧化酶proPO

1.6天蚕素

1.6.1天蚕素抗菌肽的作用机制

1.6.2抗菌肽杀伤作用的高度选择性

1.6.3天蚕素抗菌肽的用途

1.7本研究的目的与意义

2材料与方法

2.1试验材料

2.1.1试验动物

2.1.2抗菌肽（天蚕素）饲料的配制

2.1.3主要仪器设备

2.1.4主要试剂

2.1.5常用溶液配制

2.1.6主要数据库及生物软件

2.2试验方法

2.2.1体外试验

2.2.2体内实验

2.2.3凡纳滨对虾各个组织总RNA的提取

2.2.4 RNA质量和浓度检测

2.2.5反转录

2.2.6引物合成

2.2.7荧光定量PCR

2.2.8统计分析方法

3结果与分析

3.1饲喂天蚕素对凡纳滨对虾生长的影响

3.1.1饲喂天蚕素对凡纳滨对虾体重体长的影响

3.1.2人工攻毒后凡纳滨对虾的死亡率

3.2天蚕素的体外抑菌实验

3.3 RNA的提取及其质量检测

3.4免疫相关基因的qRT-PCR检测

3.5感染副溶血弧菌前后免疫相关基因在不同组织中差异表达情况

3.5.1感染弧菌前后不同组织中Toll基因的差异表达

3.5.2感染弧菌前后不同组织中IMD基因的差异表达

3.5.3感染弧菌前后不同组织中Crustin基因的差异表达

3.5.4感染弧菌前后不同组织中penaiedin 3a基因的差异表达

3.5.5感染弧菌前后不同组织中ALF基因的差异表达

3.5.6感染弧菌前后不同组织中CTL基因的差异表达

3.5.7感染弧菌前后不同组织中GPx基因的差异表达

3.5.8感染弧菌前后不同组织中proPO基因的差异表达

3.6感染副溶血弧菌前后免疫相关基因在同一组织中不同时间点差异表达

3.6.1感染弧菌前后肝胰腺中免疫相关基因的差异表达

3.6.2感染弧菌前后胃组织中免疫相关基因的差异表达

3.6.3感染弧菌前后鳃组织中免疫相关基因的差异表达

3.6.4感染弧菌前后肌肉组织中免疫相关基因的差异表达

4讨论

4.1天蚕素对凡纳滨对虾生长发育指标的影响

4.2天蚕素对凡纳滨对虾感染弧菌前后免疫相关基因表达的影响

5结论

参考文献

致谢