经修饰的天蚕素用于治疗内寄生感染和细菌感染的方法和用途

摘要

本公开内容提供一种经修饰的天蚕素蛋白质，其包含与不含C端甘氨酸的亲水尾部融合的天蚕素或其变体。本公开内容亦提供经修饰的天蚕素蛋白质或核酸用于治疗或预防内寄生物(例如疟原虫)和细菌的药物组合物、方法和用途。

说明书

相关申请

此非临时性申请要求保护来自2011年7月13日提交的美国临时申请号61/507,366的优先权，所述临时申请通过引用以其整体结合到本文中。

发明领域

本公开内容涉及经修饰的天蚕素抗微生物肽及其用于抑制内寄生物或细菌和用于治疗或预防内寄生感染或细菌感染的方法和用途。

发明背景

疟疾为蚊传播的疾病以及尽管有多年的研究，仍为导致疾病和死亡的主要全球健康问题，其严重影响发展中国家。世界卫生组织预计疟疾的全世界范围内的发生率为约每年3-5亿临床病例，至少100万人死亡。这些人中的大多数为幼儿[2008年WHO疟疾报告, Snow 等，2005，Guerra等，2008和Hay Si等，2009]。抗杀虫剂蚊虫媒介和多重耐药性寄生虫的出现促成所述疾病的再猖獗。

许多抗疟疫苗已用于对抗所述疾病，具有某些改善作用[Bejon P.等，2009]并且新型疫苗和治疗经常上市。来自这些疫苗的功效的确定很难并且因许多试验组的普遍不健康状态而加剧。迄今为止，尽管未出现高保护性的疫苗，但任何降低发病率和死亡率的疫苗均为对抗疟疾中的有价值的新工具。所述疾病的最严重形式由恶性疟原虫(Plasmodium>)导致[Casteels, P.C. 等，1989, Chopra, L. 1993]。感染在疟疾子孢子通过蚊注入宿主时开始并在数分钟内寄生虫侵入肝细胞，在此其繁殖并分化成生命周期的下一阶段——裂殖子。自肝细胞中出现的裂殖子侵入红细胞，导致临床疾病[Sturm A.等，2006]。最先进的候选疫苗(命名为RTS,S/AS02A, [Bejon P.等，2009])是基于主要的子孢子表面抗原。然而，目前处于3期临床试验的该候选疫苗在现场研究中仅显示30-65%有效性[Dauville D.等，2010]以及仍寻求具有更高水平保护的疫苗。在一段时期内，居住在其中疟疾流行的区域的人群形成对恶性疟原虫(P.>)引发的临床疾病的免疫并且取自免疫成人的免疫球蛋白G在给予患有临床疟疾的儿童时显示减少寄生虫密度和临床症状[Cohen等，1961，Bauharoun-Tayoun H.等，1990，Sabchareon A.等，1991]。因此，在生命周期的血液阶段期间表达的蛋白质为包含在疫苗中的良好候选物[Good M.F.，2001，Malkin E.等，2007]，因为血液阶段疫苗将减轻或预防所述疾病的重病和并发症。

许多微生物病原体(病毒或细菌)在其生命周期中包含第二宿主，与所述疾病主要相关的宿主相比，在许多情况下所述第二宿主不显示明显的疾病体征。在这些情况下，所述第二宿主提供在生理上允许所述病原体生长和分化的环境，而时常对其自身没有任何有害作用。在蚊中，尽管伴随疟疾，其中蚊充当用于将疟原虫属(Plasmodium)寄生虫传播给哺乳动物的有效媒介，但是蚊显示对所述寄生虫的无限制生长的多重屏障，使这部分生命周期中的繁殖降至最低[Warburg和Miller,>

很可能蚊的先天免疫系统在寄生虫生长或发育的所述限制上起重要作用并且可能为这种控制效果的优势来源。一般而言昆虫通过快速合成一系列有力的抗微生物肽因子来响应细菌或真菌感染[Hetru等，1998]。模型昆虫物种(具体为黑腹果蝇(Drosophila>))中编码这些肽的基因的克隆提供了强大的工具，使用所述工具以探索涉及诱发昆虫先天免疫反应的机制[Hoffmann等，1996]。近来，在将无脊椎动物免疫的这一基础知识应用于具有医学重要性的双翅目昆虫上取得了进步[Richman & Kafatos, 1996]。具体而言，关注聚焦于冈比亚按蚊(Anopheles>) (其为人疟原虫恶性疟原虫的最重要的非洲媒介)和黄热病的传播者埃及伊蚊(Aedes>)。此物种亦为许多其它原生动物和后生动物寄生虫的媒介。这两个昆虫物种中的体液免疫的初期研究导致称为“防御素”的一组抗微生物肽的纯化并导致编码防御素的cDNA的克隆[Chalk等，1994；Lowenberger等，1995；Cho等，1996；Richman和Kafatos, 1996]。冈比亚按蚊(A.>)和埃及伊蚊(A.>)二者均通过快速诱导防御素RNA和蛋白质来响应细菌感染[Lowenberger等，1995；Richman等，1996]。

对冈比亚按蚊的进一步研究显示，在蚊被啮齿类动物疟原虫伯氏疟原虫(Plasmodium>)感染的过程期间，体液免疫机制在多个宿主蚊组织中以及在多个时间点激活[Richman等，1997；Dimopoulos等，1998]。尽管如此，但是具免疫能力的蚊仍提供至少部分允许疟原虫生长和分化的生理环境，该事实代表了对人类健康而言意义重大的令人关注的生物学现象。

内源性体液效应分子可用于限制昆虫中的寄生虫发育或生长的程度，在很大程度上未知。在体外或当注入受感染蚊的血淋巴时，均显示防御素对某些阶段的疟原虫有效[Shahabuddin等，1998]。然而，侵入双翅目昆虫的微生物或寄生虫很可能遇见可协同起作用的多种体液防御因子。

Calvo等(2009)自达氏按蚊(A.>)的唾液腺中分离出抗微生物肽天蚕素同源物。天蚕素为存在于昆虫血淋巴中以及亦在猪肠中发现的有力的抗微生物化合物[Boman, H.G. 1991；Boman, H.G.,等，1991；Lee, J.Y.,等，1989]。它们为具有35-39个残基的强阳离子两亲α-螺旋肽以及不仅对某些革兰氏阳性菌显著有效，而且亦对革兰氏阴性菌显著有效。许多其它阳离子肽(例如来自白细胞颗粒的防御素和来自蛙皮的瓜蟾抗菌肽(magainin))在近年来亦引发大量关注[Casteels, P.C.等，1989；Diamond, G.,等，1991；Lehrer, R I.,等，1991；Nakamura, T.等，1988；Parra-Lopez, C., 1993；Zaslof, M. 1987；Zasloff, M., B.等，1988]。然而，针对大肠杆菌(Escherichia>)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas>)，天蚕素的活性为防御素和瓜蟾抗菌肽的10-30倍[Boman, H. G. 1991；Wade, D.A.等，1990]。

已显示天蚕素的强阳离子N端两亲螺旋对于与细菌膜的有效结合而言为必需的，允许其通过瓦解细胞质膜来导致细菌细胞的瞬间裂解[Christensen, B.J. 1988]。天蚕素在人工膜中形成离子通道[Christensen, B. J.等，1988]，以及通过计算机建模可预测天蚕素二聚体在膜表面上形成含通道的规则网格结构[Durell, S.R.,等，1992]。然而，这类通道可能仅在天蚕素密度较高并且膜的瓦解发生时形成[Christensen, B.J.等，1988；Durell, S.R.,等，1992]。因此，在这些研究中天蚕素的致死靶标为细菌细胞质膜。

天蚕素分子具有两亲性，这允许其通过其阳离子区与脂质样和带负电荷的分子同时相互作用，以便使其自身附着至微生物膜(Ganz T和Lehrer RI , 1998)。所述肽和靶生物之间的最初接触为静电的。其氨基酸组成、两亲性、阳离子电荷和大小允许其插入膜双分子层中，通过将其自身作为“毯”附着来贯穿膜，形成孔(Giuliani等，2007)。

除家蚕属(Bombyx)和伊蚊属(Aedes)天蚕素之外，目前为止表征的所有其他昆虫天蚕素均为C端酰胺化的。认为此翻译后修饰对于所述分子的完整抗微生物活性而言为必需的(Li等，1988；Hara等，1994)，并且可保护所述肽免受羧肽酶消化(Callaway等，1993)。在冈比亚按蚊天蚕素的推导氨基酸序列末端的甘氨酸残基的存在，表明经由末端甘氨酸去除的C端酰胺化(Bradbury & Smyth, 1991)产生完整活性的肽。

发明概述

本发明人修饰了抗微生物肽天蚕素以提供稳定性及针对内寄生物和细菌的增加的活性。

因此，本公开内容提供与不含C端甘氨酸的亲水尾部融合的天蚕素或其变体。在一个实施方案中，所述亲水尾部包含3-24个氨基酸，任选8-16个氨基酸，任选3、8、16或24个氨基酸。在一个实施方案，所述经修饰的天蚕素包含如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列或其变体。在另一个实施方案中，所述经修饰的天蚕素包含如SEQ ID NO:6所示氨基酸序列或其变体。在又另一个实施方案中，所述经修饰的天蚕素包含如SEQ ID NO:8所示氨基酸序列或其变体。在又一个实施方案中，所述经修饰的天蚕素包含如SEQ ID NO:10所示氨基酸序列或其变体。

在另一个实施方案中，本公开内容提供编码本文所公开的修饰天蚕素的核酸分子。在一个实施方案中，所述核酸编码具有如SEQ ID NO:2、6、8或10所示氨基酸序列或其变体的修饰天蚕素，或者具有如SEQ ID NO:1、5、7或9所示核酸序列或其变体。包含本文所公开的核酸分子的载体亦包括在内。另外提供的是包含本文所公开的载体的宿主细胞。在一个实施方案中，所述宿主细胞为酵母细胞。

在又另一个实施方案中，本公开内容提供包含本文所公开的修饰天蚕素、本文所公开的核酸分子、本文所公开的载体或本文所公开的宿主细胞以及药学上可接受的载体的药物组合物。

在又一个实施方案中，本公开内容提供抑制内寄生物或细菌的方法，所述方法包括向有需要的动物给予本文所公开的修饰天蚕素、本文所公开的核酸、本文所公开的载体或本文所公开的宿主细胞。本文亦提供的是本文所公开的修饰天蚕素、本文所公开的核酸、本文所公开的载体或本文所公开的宿主细胞用于在有需要的动物中抑制内寄生物或细菌的用途。本文另外提供的是本文所公开的修饰天蚕素、本文所公开的核酸、本文所公开的载体或本文所公开的宿主细胞在制备药剂中的用途，所述药剂用于在有需要的动物中抑制内寄生物或细菌。本文甚至还提供的是用于在有需要的动物中抑制内寄生物或细菌的本文所公开的修饰天蚕素、本文所公开的核酸、本文所公开的载体或本文所公开的宿主细胞。

在又一个实施方案中，本公开内容提供治疗或预防内寄生物或细菌感染的方法，所述方法包括向有需要的动物给予本文所公开的修饰天蚕素、本文所公开的核酸、本文所公开的载体或本文所公开的宿主细胞。本文亦提供的是本文所公开的修饰天蚕素、本文所公开的核酸、本文所公开的载体或本文所公开的宿主细胞用于在有需要的动物中治疗或预防内寄生物或细菌感染的用途。本文另外提供的是本文所公开的修饰天蚕素、本文所公开的核酸、本文所公开的载体或本文所公开的宿主细胞在制备药剂中的用途，所述药剂用于在有需要的动物中治疗或预防内寄生物或细菌感染。本文甚至还提供的是用于在有需要的动物中治疗或预防内寄生物或细菌感染的本文所公开的修饰天蚕素、本文所公开的核酸、本文所公开的载体或本文所公开的宿主细胞。在一个实施方案中，所述内寄生感染为疟疾。在另一个实施方案中，所述细菌感染为大肠杆菌(E.>)或假单胞菌属(Pseudomonas)感染。

在一个实施方案中，将本文所公开的修饰天蚕素、本文所公开的核酸、本文所公开的载体或本文所公开的宿主细胞经口给予或使用。

本公开内容的其它特征和优点将从下列详述中变得显而易见。然而应理解的是，尽管所述详述和具体实施例指出本公开内容的实施方案，但是其仅以说明性方式给出，因为从本详述中，本公开内容的精神和范围之内的各种变化和修改将变为对本领域技术人员而言显而易见。

附图简述

现在将联系附图来阐述本公开内容，其中：

图1显示0839314_Cecr_pMA的质粒图谱。

图2显示用于将经修饰的天蚕素基因转化到酵母中的质粒的结构。

图3显示表达修饰天蚕素的酵母对恶性疟原虫的致死率的IC₅₀值。

图4显示在给予低剂量的表达修饰天蚕素的酵母之后寄生虫血症的百分比。

图5显示在给予高剂量的表达修饰天蚕素的酵母之后寄生虫血症的百分比。

图6显示在感染后第5-7天向小鼠给予高剂量和低剂量的表达修饰天蚕素的酵母的寄生虫血症的百分比。图7显示与以高剂量给予3次的不含天蚕素的酵母提取物以及未处理组相比，以高剂量给予1次和3次的表达修饰天蚕素的酵母提取物的寄生虫血症的百分比。

图8显示在感染后第1-4天向小鼠给予高剂量和低剂量的表达修饰天蚕素的酵母的小鼠的相对体重。

图9显示在未处理、对照、低剂量和高剂量组中寄生虫血症的发作和模式。

图10显示在未处理、低剂量和高剂量组中寄生虫血症的发作和模式。

图11显示在使用经修饰的天蚕素处理之后在大肠杆菌数量上的减少。使大肠杆菌细胞在LB肉汤中于37℃生长过夜。用水将细胞连续稀释直至10⁶个细胞/mL并分成1mL等份。将所述等份分成三组；对照、MP>

图12A显示不含融合标签的天蚕素的亲水性曲线。氨基酸序列在图表上方显示(SEQ ID NO:13)。在1之上的线为亲水的。所述曲线使用Hoop TP和Woods KR (1981)推导；图12B显示具有8氨基酸融合标签的天蚕素的亲水性曲线。在1之上的线表示亲水特性。序列在图表上方显示(SEQ ID NO:2)。所述曲线使用Hoop TP和Woods KR (1981)推导。

图13A显示具有3氨基酸融合标签的天蚕素的亲水性曲线。在1之上的线表示亲水特性。序列在图表上方显示(SEQ ID NO:10)。所述曲线使用Hoop TP和Woods KR (1981)推导；图13B显示具有16氨基酸融合标签的天蚕素的亲水性曲线。在1之上的线表示亲水特性。序列在图表上方显示(SEQ ID NO:6)。所述曲线使用Hoop TP和Woods KR (1981)推导；图13C显示具有24氨基酸融合标签的天蚕素的亲水性曲线。在1之上的线表示亲水特性。序列在图表上方显示(SEQ ID NO:8)。所述曲线使用Hoop TP和Woods KR (1981)推导：图13D显示具有32氨基酸融合标签的天蚕素的亲水性曲线。在1之上的线表示亲水特性。序列在图表上方显示(SEQ ID NO:12)。所述曲线使用Hoop TP和Woods KR (1981)推导。

图14显示表达具有不同羧基端尾长的修饰天蚕素的酵母对恶性疟原虫的致死率的IC₅₀值。MP-：阴性对照(酵母裂解物)。MP3：具有3氨基酸尾部的修饰天蚕素，MP8：具有8氨基酸尾部的修饰天蚕素，MP16：具有16氨基酸尾部的修饰天蚕素，MP24：具有24氨基酸尾部的修饰天蚕素。

图15显示经口给予的含MP的完整酵母和不含MP的完整酵母的作用。用天蚕素处理的小鼠(MP+)在试验全程均为健康的并且就寄生虫计数而言在其与对照之间存在显著差异。

发明详述

本发明人工程改造了经修饰的天蚕素蛋白质，其具有与天蚕素的C端甘氨酸残基融合的附加的亲水尾部。所得经修饰的蛋白质在C末端不含甘氨酸，允许所述肽在给予时避免被酶酰胺化。如果所述肽为酰胺化的，则其变得非常稳定到这样的程度，预计其在宿主中诱导抗体并且制备自所述肽的任何药物均会失效。向C端甘氨酸添加亲水尾部使所述肽免受羧肽酶消化，即提供足够的稳定性(Khmelnitsky等，1991)以使所述肽在发挥其对内寄生物或细菌的作用之前不会消失。所述尾部亦提供天蚕素与内寄生物或细菌的改善的静电结合。所述经修饰的天蚕素(其具有稳定性和改善的结合两者)在治疗或预防内寄生感染(例如疟疾)和细菌感染中有用。

即便定义仅存在于一部分中，本文所公开的定义亦适用于本公开内容各处。

蛋白质和核酸

本公开内容提供经修饰的天蚕素蛋白质，其包含与不含C端甘氨酸的亲水尾部融合的天蚕素或其变体。

意图本文使用的术语“天蚕素”是指来自任何物种、形式或来源并且通常大小范围在35-39个氨基酸的抗微生物肽天蚕素。意图术语“天蚕素核酸”包含编码天蚕素抗微生物肽的核酸。天蚕素A [黑腹果蝇]的DNA、mRNA和蛋白质序列存在于GeneBank AAF57025.1中。天蚕素 B [黑腹果蝇]的DNA、mRNA和蛋白质序列存在于来自达氏按蚊(Anopheles>)的GenBank: AAF57027.1，NCBI检索号AD-57-208657655 (SEQ ID NO:13)，以及Gene Bank检索号为ACI30167。来自黑腹果蝇的天蚕素 C的DNA、mRNA和蛋白质序列Gene Bank检索号为AAF 57028。来自家蚕(Bombyx mori)的天蚕素 D的DNA、mRNA和蛋白质序列存在于GenBank BAA31507.1中。

蛋白质的天蚕素家族在结构上相关但在结合和裂解多种靶内寄生物和细菌的功效上不同。两种新型的裂解肽(SB-37和Shiva-1)在体外杀死恶性疟原虫和克氏锥虫(Trypanosoma>)。暴露给这些肽的受恶性疟原虫感染的人红细胞和受克氏锥虫(T.>)感染的Vero细胞显示在寄生虫感染水平上的显著降低。此外，所述肽对培养基中克氏锥虫的锥鞭毛体阶段具有显著的杀细胞作用(Jaynes等，1988)，而宿主RBC未受此处理影响。

在一个实施方案中，所述天蚕素为天蚕素A蛋白或核酸。在另一个实施方案中，所述天蚕素为天蚕素B蛋白或核酸。在又另一个实施方案中，所述天蚕素为天蚕素C蛋白或核酸。在又一个实施方案中，所述天蚕素为天蚕素D蛋白或核酸。

本文使用的术语“尾部”是指与天蚕素肽的C末端融合的氨基酸序列。

本文使用的术语“融合的”是指将两个核酸融合在一起以使所得蛋白质作为单个蛋白质表达。具体而言，将天蚕素或其变体的3’核酸残基与所述尾部的5’核酸残基结合。

本文使用的术语“亲水的”是指蛋白质的表面亲水性(或亲和力)及其针对通过诸如水等溶剂的变性的稳定性。肽的亲水性可使用Hoop-Woods标尺来预测(Hoop和Woods, 1981)，所述标尺设计成预测多肽的潜在抗原区。大于0的值为亲水的并因此很可能暴露在折叠蛋白质的表面。图11显示来自Calvo等，2009的天蚕素的亲水性以及具有8氨基酸亲水尾部的同一天蚕素的亲水性。图12显示具有3、16和24氨基酸亲水尾部以及32氨基酸亲水尾部的同一天蚕素的亲水性。

本文使用的短语“不含C端甘氨酸残基”是指所得经修饰的天蚕素蛋白质的C端残基，其使得所述蛋白质免受酰胺化。所述修饰天蚕素的C端残基为亲水尾部的最末氨基酸。

在一个实施方案中，所述亲水尾部包含3-24个氨基酸，任选8-16个氨基酸。在一个实施方案中，所述亲水尾部包含3-24氨基酸序列，其提供在亲水性曲线上大于0的值。在一个实施方案中，所述经修饰的天蚕素包含如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列或其变体。在另一个实施方案中，所述经修饰的天蚕素包含如SEQ ID NO:6所示氨基酸序列或其变体。在又另一个实施方案中，所述经修饰的天蚕素包含如SEQ ID NO:8所示氨基酸序列或其变体。在又一个实施方案中，所述经修饰的天蚕素包含如SEQ ID NO:10所示氨基酸序列或其变体。

在另一个实施方案中，本公开内容提供编码本文所公开的修饰天蚕素的核酸分子。在一个实施方案中，所述核酸编码具有如SEQ ID NO:2、6、8或10所示氨基酸序列或其变体的修饰天蚕素，或者具有如SEQ ID NO:1、5、7或9所示核酸序列或其变体。

意图术语“核酸分子”包括未经修饰的DNA或RNA或者经修饰的DNA或RNA。例如，本公开内容的核酸分子或多核苷酸可由以下组成：单链和双链的DNA、为单链和双链区的混合物的DNA、单链和双链的RNA、以及为单链和双链区的混合物的RNA、包含DNA和RNA的杂交分子，所述杂交分子可以是单链的或者更通常为双链的或者单链和双链区的混合物。此外，所述核酸分子可由包含RNA或DNA或者RNA和DNA二者的三链区组成。本公开内容的核酸分子亦可包含一个或多个经修饰的碱基或者对于稳定性或对于其它原因经修饰的DNA或RNA主链。“经修饰的”碱基包括例如氚标记的碱基和诸如次黄嘌呤核苷等稀有碱基。可对DNA和RNA进行各种修饰，因此“核酸分子”包括化学上、酶学上或代谢上经修饰的形式。术语“多核苷酸”应具有相应的含义。

本文使用的术语“变体”包括本文所公开的天蚕素核酸或氨基酸序列的修饰物、取代物、添加物、衍生物、类似物、片段或化学等同物，其以基本上相同的方式执行基本上相同的功能。例如，所述经修饰的天蚕素肽的变体将具有相同的功能，例如稳定性以及结合并裂解内寄生物或细菌的功能。例如，所述变体不包括在修饰蛋白质的C端插入甘氨酸的蛋白质。在一个实施方案中，所述变体包含在所述修饰蛋白质的天蚕素中的修饰。在另一个实施方案中，所述变体包含在所述修饰蛋白质的亲水尾部中的修饰。

变体亦包括具有以下氨基酸序列的肽或者具有以下核酸序列的核酸分子，所述氨基酸序列与所述修饰天蚕素蛋白质的氨基酸序列实质上或基本上为同一的，所述核酸序列与编码所述修饰天蚕素蛋白质的核酸序列实质上或基本上为同一的。

本文使用的术语“实质上同一的”或“基本上同一的”意指当例如使用本文所述方法进行最佳比对时，与第二个氨基酸序列共享至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的氨基酸序列。

本文使用的术语“序列同一性”是指两个多肽和/或核苷酸序列之间序列同一性的百分比。

为了确定两个氨基酸或核酸序列的百分比同一性，以最佳比对为目的将序列进行比对(例如可在第一个氨基酸或核酸序列的序列中引入空位用于与第二个氨基酸或核酸序列的最佳比对)。然后将相应位置的氨基酸残基或核酸残基进行比较。如果第一个序列中的位置被第二个序列中相应位置的同一氨基酸残基或核苷酸占据，则所述分子在该位置为同一的。两个序列之间的百分比同一性为所述序列共享的同一位置数量的函数(即同一性% =同一重叠位置的数量/位置总数×100%)。在一个实施方案中，所述两个序列为相同长度的。两个序列之间的百分比同一性的确定亦可使用数学算法完成。用于比较两个序列的数学算法的优选非限制性实例为如在Karlin和Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:5873-5877中改进的Karlin和Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:2264-2268的算法。所述算法已并入Altschul等，1990, J. Mol. Biol. 215:403的NBLAST和XBLAST程序。BLAST核苷酸检索可使用设置为例如分数=100，字长=12的NBLAST核苷酸程序参数进行，以获得与本公开内容的核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质检索可使用设置为例如分数-50，字长=3的XBLAST程序参数进行，以获得与本公开内容的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的空位比对，可如Altschul等，1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402所述使用Gapped BLAST。或者，PSI-BLAST可用于进行迭代检索，其探测分子之间的远缘关系(同上)。当使用BLAST、Gapped BLAST和PSI-Blast程序时，可使用各程序(例如XBLAST和NBLAST)的默认参数(参见例如NCBI网站)。用于比较序列的数学算法的另一个非限制性实例为Myers和Miller, 1988, CABIOS 4:11-17的算法。所述算法已并入ALIGN程序(2.0版本)，其为GCG序列比对软件包的部分。当利用ALIGN程序比较氨基酸序列时，可使用PAM120权重残基表，空位长度罚分12以及空位罚分4。两个序列之间的百分比同一性可使用与上述技术相似的技术(允许或不允许空位)来确定。在计算百分比同一性时，通常仅计算精确匹配。

两个多肽序列、所述两个序列的氨基酸序列之间的同一性百分比例如使用Clustal W算法(Thompson, JD, Higgins DG, Gibson TJ, 1994, Nucleic>22(22): 4673-4680.)连同BLOSUM 62评分矩阵(Henikoff S.和Henikoff J.G., 1992, Proc.> USA 89: 10915-10919.)以及空位开放罚分10和空位延伸罚分0.1来进行比对，由此获得两个序列之间的最高级匹配，其中所述序列之一的至少50%的全长参与比对。

可用于比对序列的其它方法为Needleman和Wunsch (Needleman和Wunsch. J.>, 1970, 48:443)的比对法，如通过Smith和Waterman (Smith和Waterman. Adv.>. 1981, 2:482)修改，由此获得两个序列之间的最高级匹配并在两个序列之间确定同一的氨基酸数量。计算两个氨基酸序列之间的同一性百分比的其它方法通常为本领域公认的以及包括例如Carillo和Lipton (Carillo和Lipton SIAM>. 1988, 48:1073)阐述的方法以及在Computational Molecular Biology (Computational Molecular Biology(计算分子生物学), Lesk,编辑Oxford University Press, New York, 1988, Biocomputing:>(生物计算：信息学和基因组学工程))中阐述的方法。一般地，计算机程序将用于这类计算。

术语“类似物”意指与本文所公开的修饰天蚕素序列相比已经修饰的氨基酸或核酸序列，其中所述修饰不改变如本文所述的序列的效用(例如稳定性以及与内寄生物和细菌的结合)。所述经修饰的序列或类似物与本文所公开的修饰天蚕素序列相比可具有改善的特性。制备类似物的核酸修饰的一个实例为用经修饰的碱基替换所述序列的天然存在的碱基(即腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶)之一，所述经修饰的碱基例如黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、6-甲基、2-丙基或其它烷基腺嘌呤，5-卤代尿嘧啶、5-卤代胞嘧啶、6-氮杂尿嘧啶、6-氮杂胞嘧啶和6-氮杂胸腺嘧啶，假尿嘧啶、4-硫尿嘧啶，8-卤代腺嘌呤、8-氨基腺嘌呤、8-硫代腺嘌呤、8-硫代烷基腺嘌呤、8-羟基腺嘌呤和其它8-取代的腺嘌呤，8-卤代鸟嘌呤、8-氨基鸟嘌呤、8-硫代鸟嘌呤、8-硫代烷基鸟嘌呤、8-羟基鸟嘌呤和其它8-取代的鸟嘌呤，其它氮杂和脱氮尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、腺嘌呤或鸟嘌呤，5-三氟甲基尿嘧啶和5-三氟胞嘧啶。

修饰的另一个实例为在核酸分子的磷酸酯主链、短链烷基或环烷基糖间键或短链杂原子或杂环糖间键中包含经修饰的磷或氧杂原子。例如，所述核酸序列可包含硫代磷酸酯、磷酸三酯、甲基膦酸酯和二硫代磷酸酯。

本公开内容的核酸分子的类似物的又一个实例为肽核酸(PNA)，其中DNA (或RNA)中的脱氧核糖(或核糖)磷酸酯主链被取代为聚酰胺主链，其与在肽中发现的聚酰胺主链相似(P.E. Nielsen,等Science 1991, 254, 1497)。已显示PNA类似物耐受通过酶的降解并在体内和体外具有延长的寿命。因在PNA链和DNA链之间缺乏电荷排斥所致，PNA亦与互补DNA序列更强地结合。其它核酸类似物可包含含有聚合物主链、环状主链或无环主链的核苷酸。例如，所述核苷酸可具有吗啉代主链结构(美国专利号5,034,506)。所述类似物亦可包含诸如报告基团、用于改善核酸序列的药代动力学或药效学性质的基团等基团。

可将本文所公开的修饰天蚕素蛋白质修饰成包含氨基酸取代、插入和/或缺失，其不改变所述蛋白质的稳定性和/或结合和/或激活特性。保守的氨基酸取代包括将所述蛋白质的一个或多个氨基酸取代成相似电荷、大小和/或疏水性特征的氨基酸。当仅进行保守取代时，所得类似物应在功能上等同于本文所公开的修饰天蚕素。非保守的取代包括将缀合蛋白质的一个或多个氨基酸替换成一个或多个具有不同电荷、大小和/或疏水性特征的氨基酸。

本公开内容另外包括这样的核酸分子，其因遗传密码的简并性所致在密码子序列上不同于本文所公开的任何核酸分子。

包含本文所公开的核酸分子的载体亦包括在内。所述载体亦包含用于转录和翻译插入序列的必需调控序列。合适的调控序列可来自多种来源，包括细菌、真菌、病毒、哺乳动物或昆虫基因(例如，参见Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology(基因表达技术：酶学中的方法) 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)中描述的调控序列)。适当的调控序列的选择取决于如下所述选择的宿主细胞，以及可由本领域普通技术人员容易地完成。这类调控序列的实例包括：转录启动子和增强子或RNA聚合酶结合序列、核糖体结合序列，包括翻译起始信号。此外，根据选择的宿主细胞和使用的载体，可将其它序列(例如复制起点、额外的DNA限制位点、增强子和赋予转录的可诱导性的序列)掺入表达载体中。亦将理解的是，所述必需的调控序列可由天蚕素序列和/或其侧翼区提供。

另外提供的是包含本文所公开的载体的宿主细胞。

可将重组表达载体引入宿主细胞以产生转化的宿主细胞。意图术语“转化的宿主细胞”包括能够用本公开内容的重组表达载体转化或转染的细胞。意图术语“转导”、“用……转化”、“用……转染”、“转化”和“转染”包括通过本领域已知的许多可能的技术之一将核酸(例如载体或裸露的RNA或DNA)引入细胞中。可通过例如电穿孔或氯化钙介导的转化用核酸转化原核细胞。例如，可经由常规技术将核酸引入哺乳动物细胞中，所述技术例如磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂转染(lipofectin)、电穿孔、显微注射、RNA转移、DNA转移、人工染色体、病毒载体和任何新兴的基因转移技术。用于转化和转染宿主细胞的合适方法可在Sambrook等(Molecular Cloning: A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册),第二版, Cold Spring Harbor Laboratory press (1989))及其它实验室教材中找到。

用于在哺乳动物细胞中直接表达的合适表达载体通常包含启动子(例如来源于诸如多瘤病毒、腺病毒2、巨细胞病毒和猿猴病毒40等病毒物质)以及其它转录和翻译控制序列。哺乳动物表达载体的实例包括pCDM8 (Seed, B., Nature 329:840 (1987))、pMT2PC (Kaufman等，EMBO J. 6:187-195 (1987))和pCMV (Clontech, California, U.S.A.)。

合适的宿主细胞包括多种原核和真核宿主细胞。例如，本公开内容的蛋白质可在诸如大肠杆菌等细菌细胞、昆虫细胞(使用杆状病毒)、酵母细胞、藻细胞或哺乳动物细胞中表达。其它合适的宿主细胞可在Goeddel (Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology(基因表达技术：酶学中的方法) 185, Academic Press, San Diego, CA 1990)中找到。在一个实施方案中，所述宿主细胞为酵母细胞。在另一个实施方案中，所述宿主细胞为藻细胞。

本文所公开的蛋白质亦可利用蛋白质化学中众所周知的技术通过化学合成来制备，所述技术例如固相合成(Merrifield, J. Am. Chem. Assoc. 85:2149-2154 (1964)；Frische等，J. Pept. Sci. 2(4): 212-22 (1996))或在均相溶液中合成(Houbenweyl, Methods of Organic Chemistry(有机化学的方法), E. Wansch编辑,第15卷 I和II, Thieme, Stuttgart (1987))。

术语“分离的氨基酸序列”是指当通过重组技术产生时，基本上不含细胞物质或培养基的氨基酸。

药物组合物

在又另一个实施方案中，本公开内容提供药物组合物，其包含本文所公开的修饰天蚕素、本文所公开的核酸、本文所公开的载体或本文所公开的宿主细胞，以及药学上可接受的载体。

所述药物组合物可通过用于制备药学上可接受的组合物(其可给予患者)的本身已知的方法制备，使得将有效量的活性物质与药学上可接受的溶媒在混合物中组合。合适的溶媒例如在Remington's Pharmaceutical Sciences (Remington's Pharmaceutical Sciences(Remington的药物科学), Mack Publishing Company, Easton, Pa., USA 2003-第20版)以及在1999年出版的The United States Pharmacopeia:The National Formulary(美国药典：国家处方集) (USP 24 NF19)中所述。

以此为基础，所述药物组合物包含(但非排他性地)活性化合物或物质连同一种或多种药学上可接受的溶媒或稀释剂，其包含在具有合适pH并与生理流体等渗的缓冲溶液中。所述药物组合物可额外包含诸如其它抗疟剂等其它药物。例如，对于疟疾感染，典型药物包括但不限于以下药品：阿莫地喹、青蒿素及衍生物、阿托伐醌、氯林肯霉素、氯喹和羟氯喹、多西环素、卤泛群、甲氟喹、伯氨喹、氯胍、乙胺嘧啶、磺胺类药物。

方法和用途

在又一个实施方案中，本公开内容提供抑制内寄生物或细菌的方法，其包括向有需要的动物给予本文所公开的修饰天蚕素、本文所公开的核酸、本文所公开的载体或本文所公开的宿主细胞。本文亦提供的是本文所公开的修饰天蚕素、本文所公开的核酸、本文所公开的载体或本文所公开的宿主细胞用于在有需要的动物中抑制内寄生物或细菌的用途。本文还提供的是本文所公开的修饰天蚕素、本文所公开的核酸、本文所公开的载体或本文所公开的宿主细胞在制备药剂中的用途，所述药剂用于在有需要的动物中抑制内寄生物或细菌。本文甚至还提供的是用于在有需要的动物中抑制内寄生物或细菌的本文所公开的修饰天蚕素、本文所公开的核酸、本文所公开的载体或本文所公开的宿主细胞。

在一个实施方案中，提供了抑制内寄生物或细菌的方法，其包括给予与不含C端甘氨酸的亲水尾部融合的天蚕素或其变体。本文亦提供的是与不含C端甘氨酸的亲水尾部融合的天蚕素或其变体用于在有需要的动物中抑制内寄生物或细菌的用途。本文还提供的是与不含C端甘氨酸的亲水尾部融合的天蚕素或其变体在制备药剂中的用途，所述药剂用于在有需要的动物中抑制内寄生物或细菌。甚至还提供的是用于在有需要的动物中抑制内寄生物或细菌的与不含C端甘氨酸的亲水尾部融合的天蚕素或其变体。

本文使用的术语“内寄生物”是指生活在另一种生物(动物)之中/之上的生物并且其从宿主获取营养而不会有利于或杀死宿主，以及包括但不限于原生动物寄生虫，例如球虫(Coccidia) (例如隐孢子虫属(Cryptosporidium))、利什曼原虫属(Leishmania)、疟原虫(Plasmodia)、弓浆虫属(Toxoplasma)、毛滴虫属(Trichomonas)和锥虫属(Trypanosoma)，以及蠕虫寄生虫，例如弓蛔虫属(Toxocara)和片吸虫属(Fasciola)；动物性寄生虫，例如蛔虫属(Ascarids)、弓蛔虫属、弓蛔线虫属(Toxascaris)、钩虫属(Ancylostoma) (十二指肠虫(Hookworm))、鞭虫属(Trichuris) (鞭虫(Whipworm))、恶丝虫属(Dirofilaria) (恶丝虫(Heartworm))和血管圆线虫属(Angiostrongylidae) (肺蠕虫 (Lungworm))。

本文使用的术语“细菌”是指引发细菌感染的原核微生物，所述细菌感染包括但不限于大肠杆菌感染、假单胞菌感染、肠杆菌(Enterobactor)>Klebsiella)>Pneumoniae)>Aerococcus)感染、蜡样芽胞杆菌(Bacillus>)感染、乳杆菌(Lactobacillus)感染、单球菌(Monococcus)感染、葡萄球菌(Staphylococcus)感染和链球菌(Streptococcus)感染。

本文使用的短语“抑制内寄生物或细菌”是指例如通过结合和/或裂解所述内寄生物或细菌的膜来抑制内寄生物或细菌的生长或活性。

在又一个实施方案中，本公开内容提供治疗或预防内寄生物或细菌感染的方法，其包括向有需要的动物给予本文所公开的修饰天蚕素、本文所公开的核酸、本文所公开的载体或本文所公开的宿主细胞。本文亦提供的是本文所公开的修饰天蚕素、本文所公开的核酸、本文所公开的载体或本文所公开的宿主细胞用于在有需要的动物中治疗或预防内寄生物或细菌感染的用途。本文还提供的是本文所公开的修饰天蚕素、本文所公开的核酸、本文所公开的载体或本文所公开的宿主细胞在制备药剂中的用途，所述药剂用于在有需要的动物中治疗或预防内寄生物或细菌感染。本文甚至还提供的是用于在有需要的动物中治疗或预防内寄生物或细菌感染的本文所公开的修饰天蚕素、本文所公开的核酸、本文所公开的载体或本文所公开的宿主细胞。

在一个实施方案中，所述内寄生物为疟疾。本文使用的术语“疟疾”是指由属于疟原虫属的寄生虫引发的感染。通常引发人感染的疟疾物种包括但不限于恶性疟原虫、卵形疟原虫(P.>)、间日疟原虫(P.>)和三日疟原虫(P.>)。

在另一个实施方案中，所述细菌为大肠杆菌或假单胞菌。

术语“给予与不含C端甘氨酸的亲水尾部融合的天蚕素或其变体”包括向动物或者在体内或在体外向细胞给予所述经修饰的天蚕素蛋白质以及给予编码所述修饰天蚕素蛋白质的核酸二者。

可在体内或离体向细胞给予本文所公开的天蚕素，随后给予所述细胞。例如，可用编码本文所公开的蛋白质的核酸转化或转导细胞并随后体内给予所述细胞。

本文使用的术语“处理”或“治疗”意指给予受试者治疗上有效量的本文公开内容的组合物、核酸或蛋白质并且可由单次给予组成或包含一系列施用。

如本文所用以及如本领域所熟知，“治疗”或“处理”亦为用于获得有益的或所需的结果(包括临床结果)的途径。有益的或所需的临床结果可包括但不限于缓解或改善一种或多种症状或病况、减轻疾病的程度、使疾病的状态稳定(即不恶化)、防止疾病的扩散、延迟或减慢疾病进程、改善或减轻疾病状态以及缓和(不论是部分还是全部)，不论是可检测的还是不可检测的。“治疗”亦可意指与未接受治疗的预期生存相比延长生存。此外，本文所述的任何治疗方法或用途可单独制剂或者用于与其它药物或疗法同期给予。“治疗”或“处理”亦可包括预防疾病的发生。

术语本公开内容化合物或组合物的“治疗上有效量”、“有效量”或“足够量”为在给予受试者(包括哺乳动物，例如人)时足以实现有益的或所需的结果(包括临床结果)的量，并因此“有效量”或其同义词取决于其所应用的情况。例如，在治疗疟疾的情况下，例如其为与未给予化合物或组合物获得的反应相比足以实现所述治疗的所述化合物或组合物的量。在疟疾的情况下，本文所公开的化合物或组合物的治疗上有效量用于治疗、调节、减弱、逆转或影响哺乳动物中的疟疾感染。意图“有效量”意指足以治疗、预防或抑制内寄生物(例如疟疾)感染和细菌感染的化合物或组合物的量。在一些合适的实施方案中，尽管给定化合物或组合物的量将根据多个因素而不同，所述因素例如给定的药物或化合物、药物配方、给予途径、疾病或病症的类型、正被治疗的受试者或宿主的特征等，但其可通过本领域技术人员常规地确定。此外，本文使用的本公开内容的化合物或组合物的“治疗上有效量”为与对照相比预防、抑制、阻抑或减轻受试者中的感染的量。如本文所定义，本公开内容的化合物或组合物的治疗上有效量可通过本领域已知的常规方法由普通技术人员容易地确定。

本文使用的术语“受试者”或“动物”包括动物界的所有成员，包括哺乳动物，适当地包括人(包括患者)。

依照本文所公开的方法，所述经修饰的天蚕素蛋白质、核酸、载体或细胞可根据选择的给予途径以多种形式给予患者，如本领域技术人员会理解的。所述化合物或组合物可例如经口、胃肠外、经颊、舌下、经鼻、经直肠、经贴剂、泵或透皮给予来给予并相应地配制药物组合物。胃肠外给予包括静脉内、腹膜内、皮下、肌内、经上皮、经鼻、肺内、鞘内、经直肠和局部的给予模式。胃肠外给予可通过在选择的一段时间内的连续输注进行。

所述化合物或组合物可与例如惰性稀释剂或与可同化的可食用载体一起经口给予，或者其可封装在硬壳或软壳胶囊中，或者其可压成片剂，或者其可直接掺入膳食的食物。对于经口治疗给予，所述化合物或组合物可掺入赋形剂并以可摄取片剂、口含片剂、糖锭剂(troche)、胶囊剂、酏剂、混悬剂、糖浆剂、糯米纸囊剂(wafer)等形式使用。

本文公开的化合物或组合物亦可胃肠外给予。可在与如诸如羟丙基纤维素等表面活性剂适当混合的水中制备溶液剂。亦可在含或不含醇的甘油、液态聚乙二醇、DMSO及其混合物中以及在油中制备分散剂。在储存和使用的普通条件下，这些制品含有阻止微生物生长的防腐剂。本领域技术人员会知道如何制备合适的制剂。用于选择和制备合适制剂的常规程序和成分在例如Remington's Pharmaceutical Sciences (2000-第20版)和1999年出版的The United States Pharmacopeia: The National Formulary (美国药典：国家处方集) (USP 24 NF19)中阐述。

适于注射用途的药物形式包括无菌水溶液或分散剂以及用于临时配制无菌注射溶液剂或分散剂的无菌粉末。在所有情况下，所述形式必须为无菌的并且就存在容易注射性方面来说必须是流体的。

用于经鼻给予的组合物可合宜地配制为气雾剂、滴剂、凝胶剂和散剂。气雾剂制剂通常包括活性物质在生理学上可接受的水性或非水性溶剂中的溶液或细混悬剂并且通常以无菌形式的单剂量或多剂量存在于密封容器中，所述容器可采用与雾化装置一起使用的药筒或再填充物的形式。或者，所述密封容器可以是单元配药装置(unitary dispensing device)，例如意图用后抛弃的单剂量鼻用吸入器或装配有计量阀的气雾剂分散器。当所述剂型包含气雾剂分散器时，其会包含推进剂，所述推进剂可以是压缩气体，例如压缩空气或有机推进剂，例如氟氯烃。所述气雾剂剂型亦可采用泵-喷雾器的形式。

适于经颊或舌下给予的组合物包括片剂、锭剂和软锭剂，其中将活性成分与诸如糖、阿拉伯胶、西黄蓍胶或明胶和甘油等载体一起配制。用于直肠给予的组合物合宜地为含有诸如可可脂等常规栓剂基质的栓剂形式。

本文所公开的蛋白质、核酸、载体和细胞可单独使用或与对治疗或预防内寄生物或细菌感染有用的其它已知物质组合使用。例如，对于疟疾感染，典型的治疗包括但不限于以下药物：阿莫地喹、青蒿素及衍生物、阿托伐醌、氯林肯霉素、氯喹和羟氯喹、多西环素、卤泛群、甲氟喹、伯氨喹、氯胍、乙胺嘧啶、磺胺类药物。诸如疫苗接种、处理或未处理的网、喷洒等预防性处理亦包括在内。对于细菌感染，典型的治疗包括抗生素，例如四环素、青霉素、氯霉素和氨苄西林。

当与可用于治疗或预防内寄生物或细菌感染的其它物质组合使用时，适当地将化合物与那些物质同期给予。如本文所用，向个体“同期给予”两种物质意指提供所述两种物质的每一种以使它们在所述个体中同时均为生物活性的。给予的准确详情将取决于所述两种物质在彼此存在下的药代动力学，并且可包括在彼此相隔数小时内给予所述两种物质，或者在药代动力学适应时，甚至可包括在给予一种物质的24小时内给予另一种物质。合适给药方案的设计对本领域技术人员而言为常规的。在具体的实施方案中，两种物质将基本上同时(即在彼此相隔数分钟内)给予，或者以包含两种物质的单个组合物给予。

可将本文所公开的蛋白质、核酸、载体和细胞单独给予动物或者也可如上所述与药学上可接受的载体组合给予动物，它们的比例由化合物的溶解性和化学性质、选择的给予途径以及标准药学实践决定。

本文所公开的蛋白质、核酸、载体和细胞的剂量可根据许多因素变化，所述因素例如各自的药效学特性、给予模式、受者的年龄、健康和体重、症状的性质和程度、治疗的频率和同时治疗的类型(若有的话)，以及各自在待治疗动物中的清除率。本领域技术人员可基于上述因素确定适当的剂量。可以合适的剂量初始给予本文所公开的蛋白质、核酸、载体和细胞，所述剂量可根据临床反应按需调整。

上述公开内容概括地阐述了本申请。通过参考以下具体实施例可获得更完整的理解。阐述这些实施例仅以说明为目的而不意图其限制本公开内容的范围。当情况可能表明或致使合宜时，考虑形式的变化和等同物的代替。尽管本文使用了具体术语，但意图所述术语为描述性意义的而非用于限制的目的。

以下非限制性实施例说明本公开内容。

实施例

材料和方法：

基因合成

对来自Calvo等(2009)的天蚕素基因序列进行密码子优化以在酵母细胞中表达并向其加上长度为8个氨基酸的亲水尾部。所得天蚕素的核酸和氨基酸序列分别在表1和2中显示。将此基因插入质粒中。

质粒构建

使用适当的限制性内切酶自载体质粒切下天蚕素基因，将其纯化并在BmtI-MluI位点(参见图1)连接到质粒(Leu2酵母载体)中。通过用对BmtI和MluI基因座特异的限制性内切酶进一步消化来检验克隆。

克隆和转化策略

使用LiAc利用‘Gietz & Woods’酵母转化方案进行至酵母中的转化[Geitz R D& R A Woods, 2002]。通过使用以下引物的PCR对转化的克隆检测基因的存在情况：CECR-F:>CECR-R:>

酵母中的表达

为了确认表达，使用标准“玻璃珠”法将酵母裂解并测定以确定其浓度。将转化的酵母提取物等份连同对照、未转化的酵母一起在聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳并转移到PDF膜上。然后将所述膜与天蚕素特异性抗体杂交。使用化学发光染料用BioRad gel doc系统读取阳性样品。

细菌活性的测定

一旦确定阳性克隆的表达水平，便对酵母提取物测定抗微生物活性。将大肠杆菌的过夜培养物等份在37℃培养4小时。使用分光光度计检验培养物生长并用PBS将10⁷个细菌稀释10倍。向各管中加入恒定浓度的酵母提取物，孵育2小时并接种到琼脂平板上。使用氨苄西林作为阳性对照。将平板于37℃培养过夜并进行平板计数以查看表达的修饰天蚕素的效果。

体外功效

使用针对乳酸脱氢酶(LDH)的测定法，将寄生虫(恶性疟原虫)在体外暴露给天蚕素，所述测定法通过将APAD代替NAD来特异地针对疟原虫属寄生虫的LDH酶进行。LDH活性的存在区分活疟原虫和死疟原虫。向96孔板的各孔中加入标准数量的疟原虫。将所述天蚕素-酵母提取物跨平板连续稀释。通过酶LDH的活性测定寄生虫生存力。从这些数据中，对杀死50%的寄生虫的样品中蛋白质(μg)的浓度(IC₅₀)进行计算。

毒性试验

将酵母提取物的IC₅₀浓度(推导自体外试验)的100倍浓度用于测试所述样品在小鼠(CD-1品系，18-23克个体重量)中的毒性。通过腹膜内注射(无麻醉)或经口给予所述酵母提取物。将500μl对照或天蚕素-酵母提取物通过经口管饲法直接递送到胃中或通过IP注射递送。将每组5只小鼠用于所述试验。所述试验依照美国药典规程进行。监测毒性临床体征的每日观测结果(食欲缺乏、呕吐、腹泻、躺卧)，食欲、水摄取、不适的行为体征(在角落徘徊、踱步、气促以及不能理毛)。每天两次检查动物。

透过性试验

将酵母提取物的IC₅₀浓度(推导自体外试验)的100倍浓度用于测试天蚕素穿过小鼠(CD-1品系，18-23克个体重量)肠壁的透过性。通过腹膜内注射或经口给予所述酵母提取物。将500μl对照或天蚕素-酵母提取物通过IP注射递送或通过经口管饲法直接递送到胃中。将每组5只小鼠用于所述试验。所述试验依照美国药典规程进行。48小时后，通过心脏穿刺将各100-200>

体内功效测定

用10⁶个寄生虫感染的红细胞感染小鼠并随后对寄生虫血症监测数日。通常可在感染后的第4-5天首次检测到寄生虫。在第4天给小鼠输注入高剂量或低剂量的对照或者天蚕素-酵母提取物并每日采集血样直至第14天。检测这些血样以确定寄生虫血症。将选择用以感染动物的寄生虫数量设计成产生这样的初始感染，其既不会压垮动物又不允许动物轻易清除感染。其亦是用于检测动物免疫力上的差异如何与结果相关的方法；自身对动物不利的治疗将促进感染，专一地靶定寄生虫的治疗将提供显著的益处。在实验期间注意小鼠的一般健康参数(体重、食欲缺乏、活动等)。

结果

体外功效评估

通过向各孔中加入生长培养基和一致数量的疟原虫来制备96-孔板。将此平板在37℃孵育48小时，之后将疟性细胞再混合，然后加入含天蚕素的粗制酵母裂解物样品并跨平板稀释以得到浓度梯度。疟原虫属含有具有独特的NAD类似物偏爱的乳酸脱氢酶并因此可用作寄生虫特异性生存力的指示物。活寄生虫使所述测定变蓝，其随后使用平板读数器读数。从这些颜色密度读数计算IC₅₀值；估算的IC₅₀浓度越低，试验中的物质越具致死性。

在一系列试验中确定的是，对于“对照”酵母(即不表达天蚕素)的IC₅₀值为0.95>

体内试验1：评价在三个时间点通过注射给予酵母的作用，所述酵母表达修饰形式的天然存在的蛋白质天蚕素。

用10⁶个寄生虫感染的红细胞感染小鼠并对因而发生的寄生虫血症监测8天。将感染当天命名为第0天并在第4天首次观察到寄生虫。在第4、5和6天，给小鼠输注0.36>

在图4对于低剂量给予所示的数据中，在第6天存在寄生虫数量的显著抑制并且在第5天至第7天之间存在支持趋势——接近显著。对照数量符合对于未处理对照小鼠的预期，寄生虫血症在数日内快速增加并在第7-8天附近到达平台期。

在图5对于高剂量给予所示的数据中，组间无显著差异。然而对照组中寄生虫血症的进展不符合典型的未处理小鼠组，这表明高剂量对照酵母可能影响感染的结果。在所述试验全程，用表达修饰天蚕素的酵母处理的小鼠似乎更强壮。

在第8天终止所述试验。

概括地说，注射对照低剂量酵母的动物显示典型的感染，而给予低剂量天蚕素的动物显示抑制寄生虫但并未消除寄生虫。较高剂量实验的结果并非同样明确，因为对照小鼠未经历典型感染(对于组合的低剂量和高剂量参见图6)。

体内试验2：评价在三个时间点通过注射给予酵母的作用，所述酵母表达修饰形式的天然存在的蛋白质天蚕素。

在此试验中，从检测到感染体征的第一天开始，在三个不同的时间点给小鼠注射所述天蚕素酵母。

在第0天用4×10⁵个寄生虫感染小鼠以开始感染。在第5天首次在小鼠血液中观察到寄生虫。在第5天，向组A>

组A的小鼠在第8天变得显著生病以及因担心同龄组群的健康而在第9天结束实验。图7的Y轴表示寄生虫血症的程度(寄生虫/100个RBC)。将来自组A的一只小鼠的数据剔除，因为尽管该小鼠最初在外周血中显示少量寄生虫，但感染未进展。这偶尔发生。

概括地说，小鼠在预期的时间范围内形成显著的寄生虫血症并且各组内的结果具有这类感染典型的散布量。

然而，疟疾感染通过毒素的释放在动物中引发疾病。同时降低动物的健康状态的任何治疗都将加速所述感染并在更早期导致更高的寄生虫血症。因此诸如本试验等试验显示宿主损伤(较高的寄生虫血症)和寄生虫抑制(较低的寄生虫血症)的平衡。接受低剂量和对照二者输注的动物似乎具有轻微的腹膜炎症。这可能是因为触发先天免疫的酵母产物的存在，或者可能的是，如果所述酵母为小鼠正常菌群的部分，则所述小鼠具有对酵母提取物的某些预存免疫。组C和D中的小鼠在第9天亦似乎“欠佳”。然而这是主观测定，其往往与寄生虫血症不相关。因此，一般健康的更佳测定为体重减轻。

体内试验3：评价在三个时间点通过注射给予酵母的作用，所述酵母表达修饰形式的天然存在的蛋白质天蚕素。

在此试验中，在感染开始的同时在三个不同的时间点给小鼠注射天蚕素酵母。

使用标准方案开始感染，预期该方案在第5天显示最初的临床体征。在第1、2、3和4天给予天蚕素酵母。以200 μg/天给予低剂量处理(总共800 μg)并以1 mg/天给予高剂量(总共4 mg)。以1 mg/天给予对照酵母(不表达天蚕素)。使另一组小鼠不用任何形式的给予进行处理。

测定的参数为体重(图8)、寄生虫血症(图9和10)以及一般健康的主观评价。

就一般健康而言，未处理和对照酵母组比天蚕素处理组早一天或两天显示疟疾的体征。接受1 mg天蚕素/天的组显示比对照略微更健康。相比之下，在最后两天，接受低剂量(200 μg/天)的组比任何其它组显著更健康。尽管这些观察结果为主观的，但其均以“盲法”对未标记的组进行。

抑制大肠杆菌活性：

使大肠杆菌细胞在LB肉汤中于37℃生长过夜。用水将细胞连续稀释直至10⁶个细胞/mL并分成1mL等份。将所述等份分成3组；对照、MP和阳性对照。使用提取自野生型CC11酵母菌株的20ug总可溶性蛋白质处理对照组。使用提取自经修饰的酵母菌株(其表达经修饰的抗微生物肽)的20ug总可溶性蛋白质处理MP组。使用50ng氨苄西林处理阳性对照组。简单说来，向稀释的细胞中加入所述处理并充分混合。使细胞-蛋白质混合物在37℃孵育20>

其它亲水尾部

合成了具有范围从3个氨基酸到24个氨基酸的亲水尾部的修饰天蚕素，例如在表3-5中列举的修饰天蚕素。发现不可能将编码32个氨基酸长度的尾的片段碱基掺入基因中。将所述基因商业合成、克隆以及在酵母中表达，并且使用体外功效方案检测各克隆以显示对抗内寄生物和/或细菌的功效。

对寄生虫的体外功效

使用LDH测定法，通过体外暴露给经修饰的天蚕素显示杀死寄生虫(恶性疟原虫)，所述测定法通过将APAD代替NAD而对寄生虫LDH酶为特异的。LDH活性的存在区分活疟原虫和死疟原虫。从这些数据中，对杀死50%的寄生虫的样品中蛋白质(μg)的浓度(IC₅₀)进行计算；抗寄生虫活性越强，达到50%杀伤所需的剂量越低。如上所述，对于对抗内寄生物的体外测试，将材料在96孔板中连续稀释，以及作为对照，平板上的最末列不添加任何试验材料(即其仅为酵母裂解物)。然后向各孔中加入恒定数量的寄生虫并使培养物生长48小时。然后通过测定寄生虫特异性LDH活性或者使用SYBR>50值。

对于各经修饰的天蚕素肽的IC₅₀值在图14和下表中提供：

测试项目IC₅₀>对照242.6123 aa0.0308 aa0.02416 aa0.01624 aa0.030

与对照值相比，各测试项目均显示对抗疟原虫寄生虫的显著功效，其通过在各种情况下显著更低的IC₅₀值证实。在不同的尾长之间不存在显著差异。

对细菌的体外功效

对于对抗细菌的体外测试，使大肠杆菌细胞在LB肉汤中于37℃生长过夜。用水将细胞连续稀释直至10⁶个细胞/mL并分成1mL等份。然后将所述等份分成3组；对照、MP和阳性对照。使用提取自野生型CC11酵母菌株的20ug总可溶性蛋白质处理对照组。使用提取自经修饰的酵母菌株(其表达推定的抗微生物肽)的20ug总可溶性蛋白质处理MP组。然后使用5ng氨苄西林处理阳性对照组。简单说来，向稀释的细胞中加入所述处理并充分混合。使细胞-蛋白质混合物在37℃孵育20>

然后如本文所公开的，对鉴定为具有抗菌活性的修饰天蚕素测试体内功效。

体内试验4：以每天500μg/小鼠的剂量向小鼠经口给予(经口管饲法)>

此实验检测向小鼠经口(通过管饲法)给予酵母细胞对鼠科疟原虫(伯氏疟原虫)感染结果的作用，所述酵母细胞包含通过添加8氨基酸亲水尾部修饰的蛋白质(MP)。将小鼠分成2组，每组8只小鼠。依照用于注射的标准方案，对所述小鼠腹膜内注射10⁶个寄生虫。向组A>

处理的小鼠在所述试验全程均为健康的并且就寄生虫计数而言，它们与对照之间存在显著差异，如图所示(图15)。

尽管已参考目前认为是实施例的内容来阐述本公开内容，但是要理解的是本公开内容不限于所公开的实施例。相反的是，意图本公开内容涵盖包含在随附权利要求的精神和范围之内的各种修改和等同的改编。

所有出版物、专利和专利申请均在本文中通过引用以其整体结合，其引用程度如同具体和单独地指出各个单独的出版物、专利或专利申请通过引用以其整体结合一样。

表1.优化后的修饰天蚕素基因的核苷酸序列(SEQ>

表2.具有尾部的氨基酸序列(SEQ>

表3.具有16氨基酸尾部的修饰天蚕素的核酸和氨基酸序列：

核酸：

氨基酸：

表4.具有24氨基酸尾部的修饰天蚕素的核酸和氨基酸序列：

核酸：

氨基酸：

表5.具有3氨基酸尾部的修饰天蚕素的核酸和氨基酸序列：

核酸：

氨基酸：

表6.具有32氨基酸尾部的修饰天蚕素的核酸和氨基酸序列：

核酸：

氨基酸：

。

参考文献

Bouharoun-Tayoun H, Attanath P, Sabchareon A, Chongsuphajaisiddhi T, Druilhe P (1990) Antibodies that protect humans against Plasmodium falciparum blood stages do not on their own inhibit parasite growth and invasion in vitro but act in cooperation with monocytes (针对恶性疟原虫血液阶段保护人类的抗体不以其本身在体外抑制寄生虫生长和入侵但与单核细胞协同起作用).J Exp Med 172: 1633-1641.

Beier, J.C. (1998) Malaria parasite Development in mosquitoes(疟原虫在蚊中的发育).Ann Rev Entomol 43:519-543.

Boman, H. G. 1991. Antibacterial peptides:key components needed in immunity(抗菌肽：免疫所需的关键组分).Cell 65:205-207.

Boman, H. G., L Faye, H. Gudmundsson, J.-Y. Lee,和D.-A. Lidholm. 1991. Cell-free immunity in Cecropia. A model system for antibacterial proteins(伞树科中的无细胞免疫.用于抗菌蛋白质的模型系统).Eur. J. Biochem. 201:23-31.

Bradbury, A.F.和Smyth, D.G. 91991) Peptide amidation(肽酰胺化).Trends Biochem. Sci. 16:112-115.

Callaway, J.E., Lai, J., Haselbeck, B., Baltaian, M., Bonnesen, S.P., Weickmann, J., Wilcox, G.和Lei, S.P. (1993) Modification of the C-terminus of cecropin is essential for broad-spectrum antimicrobial activity(天蚕素的C端修饰对广谱抗微生物活性而言必不可少).Antimicrob. Agents Chemother. 37:1614-1619.

Chopra, L 1993. The magainins: antimicrobial peptides with potential for topical application(瓜蟾抗菌肽：具有局部应用潜力的抗微生物肽).J. Antimicrob. Chemother. 32: 351-353.

Casteels, P., C. Ampe, F. Jacobs, M. Vaeck,和P. Tempst. 1989. Apidaecins: antibacterial peptides from honeybees (蜜蜂抗菌肽：来自蜜蜂的抗菌肽).EMBO J. 8:2387-2391.

Chalk, R., Townson, H., Natori, S., Desmond, H.和Ham, P.J.(1994) Purification of an insect defensin from the mosquito,Aedes aegypti (来自蚊(埃及伊蚊)的昆虫防御素的纯化).Insect Biochem Mol Biol 24: 403-410.

Cho, W.L., Fu, Y.C., Chen, C.C.和Ho, C.M. (1996) Cloning and characterization of cDNAs encoding the antibacterial peptide, defensin A, from the mosquito, Aedes aegypti (编码来自蚊(埃及伊蚊)的抗菌肽(防御素A)的cDNA的克隆和表征).Insect. Biochem Mol Biol 26: 395-402.

Cohen S, McGregor IA, Carrington S (1961) Gamma-globulin and acquired immunity to human malaria (γ-球蛋白和针对人疟疾的获得性免疫).Nature 192: 733-737.

Casteels, P., C. Ampe, F. Jacobs, M. Vaeck,和P. Tempst. 1989. Apidaecins: antibacterial peptides from honeybees (蜜蜂抗菌肽：来自蜜蜂的抗菌肽).EMBO J. 8:2387-2391.

Christensen, B., J. Fink, R. B. Merrifield,和D. Mauzerall. 1988. Channel-forming properties of cecropins and related model compounds incorporated into planar lipid membranes (并入平面脂质膜中的天蚕素和相关模型化合物的通道形成特性).Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5072-5076.

Dimopoulos, G., Seeley, D., Wolf, A.和Kafatos, F.C. (1998) Malaria infection of the mosquito Anopheles gambiae activates immune-responsive genes during critical stages of the parasite life cycle (冈比亚按蚊的疟疾感染在寄生虫生命周期的关键阶段中激活免疫应答基因).EMBO J 17: 6115-6123.

Diamond, G., M. Zasloff, H. Eck, M. Bressaur, W. L. Maloy,和C. L Bevins. 1991. Tracheal antimicrobial peptide, a novel cysteine-rich peptide from mammalian tracheal mucosa: peptide isolation and cloning of a cDNA (气管抗微生物肽，来自哺乳动物气管粘膜的一种新型富半胱氨酸肽：肽分离和cDNA的克隆).Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:3952-3956.

Durell, S. R., G. Raghunathan,和H. R Guy. 1992. Modeling the ion channel structure of cecropin (对天蚕素的离子通道结构进行建模).Biophys. J. 63:1623-1631.

Dauvillée D, Delhaye S, Gruyer S, Slomianny C, Moretz SE,等(2010) Engineering the Chloroplast Targeted Malarial Vaccine Antigens in Chlamydomonas>

Dauvillée D, Chochois V, Steup M, Haebel S, Eckermann N,等(2006) Plastidial phosphorylase is required for normal starch synthesis in Chlamydomonas reinhardtii (质体磷酸化酶为莱茵衣藻中的正常淀粉合成所必需).Plant Journal 48: 274-285.

Eric Calvo, Van M Pham, Osvaldo Marinotti, John F Andersen和José MC Ribeiro. The salivary gland transcriptome of the neotropical malaria vector Anopheles>reveals accelerated evolution of genes relevant to Hematophagy (新热带区疟疾媒介达氏按蚊的唾液腺转录组显示与吸血相关的基因的加速进化). BMC Genomics 2009, 10:57 doi:10.1186/1471-2164-10-57

Ganz T. Lehrer RI. Antimicrobial peptides of vertebrates (脊椎动物的抗微生物肽). Curr. Opin. Immunol.1998 10:41-4.

Gietz, R.D.和R.A. Woods. (2002) Transformation of Yeast by the Liac/SS Carrier DNA/PEG Method (通过Liac/SS载体DNA/PEG法转化酵母). Methods in Enzymology 350: 87-96.

Guerra CA, Gikandi PW, Tatem AJ, Noor AM, Smith DL,等(2008) The limits and intensity of Plasmodium falciparum transmission: implications for malaria control and elimination worldwide (恶性疟原虫传播的限制和强度:全世界范围内疟原虫控制和消除的问题). PLos Med 5: 38.

Good MF (2001) Towards a blood-stage vaccine for malaria: are we following all the leads (朝着用于疟疾的血液阶段疫苗:我们是否遵循了全部指引). Nat Rev Immunol 1: 117-125.

Guiliani, A; Pirri, G; Nicoletto, S (March 2007) ‘Antimicrobial peptides: an overview of a promising class of therapeutics”(‘抗微生物肽:有前景的一类治疗药的综述”) Cent. Eur. J. Biol 2 (1): 1-33, doi: 10.2478/s 1135-007-0010-5.

Hara, S., Taniai, K., Kato, Y.和Yamakawa, M. (1994) Isolation and a-amidation of the non-amidated from for cecropin D from larvae of Bombyx mori (来自家蚕幼虫的未酰胺化天蚕素D的分离和a-酰胺化). Comp. Biochem. Physiol. 108:303-308.

Hay SI, Guerra CA, Gething PW, Patil AP, Tatem AJ,等(2009) A world malaria map: Plasmodium falciparum endemicity in 2007 (世界疟疾地图：2007年的恶性疟原虫地方流行性). PLoS Med 6: e1000048.

Hetru, C ., Hoffmann, D和Bulet, P (1998) Antimicrobial peptides from Insects. In molecular mechanism of Immune Responses in Insects (来自昆虫的抗微生物肽.在昆虫中的免疫反应的分子机制) (Brey, P.T和Hultmark, D.编辑)，第40-66页，Chapman & Hall London.

Hoffmann, J.A., Reichhart, J.M和hetru, C (1996) Innate immunity in higher insects (高等昆虫中的先天免疫).Curr Opin Immunol 8: 8-13.

Hoop TP和Woods KR (1981) Prediction of protein antigenic determinants from amino acid sequences (从氨基酸序列预测蛋白质抗原决定簇).Proc Natl Acad Sci USA 78:3824.

JAYNES, J. M.; BURTON, C. A.; BARR, S. B.; JEFFERS,G. W.; JULIAN, G. R.; WHITE, K. L.; ENRIGHT, F. M.;KLEI, T R.; LAINE, R. A. In vitro cytocidal effect of novel lytic peptides on Plasmodium>and Trypanosoma> (新型裂解肽对恶性疟原虫和克氏锥虫的体外杀细胞作用).FASEBJ 2: 2878-2883; 1988.

Khmelnitsky, Y.L., Belova, A.B., Levashov, A.V.和Mozhaev, V.V. (1991) Relationship between surface hydrophilicity of a protein and its stability against denaturation by organic solvents (蛋白质的表面亲水性及其针对有机溶剂变性的稳定性之间的关系).FEBS Lett. 284(2):267-9.

Lehrer, R I., T. Ganz,和M. E. Selsted. 1991. Defensins: endogenous antibiotic peptides of animal cells (防御素：动物细胞的内源抗菌肽).Cell 64:229-230.

Li, Z.Q., Merrifiled, R.B., Boman, I.A.,和Boman, H.G. (1988) Effects on electrophoretic mobility and antimicrobial spectrum of removal of two residues from synthetic sarcotoxin IA and addition of the same residues to cecropin B (从合成的麻蝇素IA中去除两个残基以及向天蚕素B添加相同残基对电泳迁移率和抗微生物谱的影响).FEBS Lett. 231:299-302.

Lowenberger, C., Bulet, P., Charlet, M., Hetru, C., Hodgeman, B.,Christensen, B.M.和Hoffmann, J.A. (1995) Insect immunity:isolation of three novel inducible antibacterial defensins from the vector mosquito, Aedes aegypti (昆虫免疫：从媒蚊埃及伊蚊中分离三种新型可诱导的抗菌防御素).Insect Biochem Mol Biol 25: 867-873.

Malkin E, Long CA, Stowers AW, Zou L, Singh S,等(2007) Phase 1 study of two merozoite surface protein 1 (MSP 1 (42) vaccines for Plasmodium falciparum malaria (用于恶性疟原虫疟疾的两种裂殖子表面蛋白1 (MSP 1 (42)疫苗的1期研究).Plos Clin Trials 2: e12.

Nakamura, T., H. Furunaka, T. Miyata, F. Tokunaga, T. Muta, S. Iwanaga, M. Niwa, T. Takao,和Y. Shimonishi. 1988. Tachyplesin, a class of antimicrobial peptides from the hemocytes of the horseshoe crab (Tachypleus tridentatus) (速普肽，来自鲎(中华鲎)血细胞的一类抗微生物肽).J. Biol. Chem. 263:16709-16713.

Philip Bejon, George Warimwe, Claire L. Mackintosh, Margaret J. Mackinnon, Sam M. Kinyanjui, Jennifer N. Musyoki, Peter C. Bull,和Kevin Marsh. Analysis of Immunity to Febrile Malaria in Children That Distinguishes Immunity from Lack of Exposure (将免疫与缺乏暴露区别开的对于儿童温疟的免疫的分析).Infect. Immun. 77 (5) 1917-1923 May 2009.

Parra-Lopez, C., M. T. Baer,和E. A. Groisman. 1993. Molecular genetic analysis of a locus required for resistance to antimicrobial peptides in Salmonella typhimurium (鼠伤寒沙门氏菌中耐受抗微生物肽所需的基因座的分子遗传分析).EMBO J. 12:4053-4062.

Richman, A.和Kafatos, F.C. (1996) Immunity to eukaryotic parasites in vector insects (媒介昆虫中对真核寄生虫的免疫).Curr Opin Immunol 8: 14-19.

Richman, A.M., Dimopoulos, G., Seeley, D.和Kafatos, F.C.(1997) Plasmodium activates the innate immune response of Anopheles gambiae mosquitoes (疟原虫激活冈比亚按蚊的先天免疫反应).EMBO J 16: 6114-6119.

Shahabuddin, M., Fields, I., Bulet, P., Hoffmann, J.A.和Miller, L.H. (1998) Plasmodium gallinaceum: differential killing of some mosquito stages of the parasite by insect defensin (鸡疟原虫：通过昆虫防御素差别地杀死某些蚊阶段的寄生虫).Exp Parasitol 89: 103-112.

Sabchareon A, Burnouf T, Ouattara D, Attanath P, Bouharoun-Tayoun H,等(1991) Parasitologic and clinical human response to immunoglobulin administration in falciparum malaria (对恶性疟中免疫球蛋白给予的寄生虫学响应和临床人体响应).Am J Trop Med Hyg 45: 297-308.

Snow RW, Guerra CA, Noor AM, Myint HY, Hay SI. The global distribution of clinical episodes of Plasmodium falciparum malaria (恶性疟原虫疟疾的临床发作的全球性分布).Nature 434: 214-217.

Sturm A, Amino R, van de Sand C, Regen T, Retzlaff S,等(2006) Manupulation of host hepatocytes by the malaria parasite for delivery into liver sinusoids (疟原虫操纵宿主肝细胞以递送到肝血窦中).Science 313: 1245-1246.

Wade, D., A. Boman, B. WAhlin, C. M. Drain, D. Andreu, H. G. Boman,和R. B. Merrifield. 1990. All-D amino acid-containing channel-forming antibiotic peptides (全部含D氨基酸的通道形成抗菌肽).Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:4761-4765.

WHO,世界疟疾报告，2008.可获自：http://apps.who.int/malaria/ wnr2008/malaria2008.pdf.

Warburg, A和Miller, L.H. (1991) critical stages in the development of Plasmodium in mosquitoes (疟原虫在蚊中发育的关键阶段).Parasitology Today 7: 179-181.

Zaslof, M. 1987. Magainins, a class of antimicrobial peptides from Xenopus skin: isolation, characterization of two active forms, and partial cDNA sequence of a precursor (瓜蟾抗菌肽，来自非洲瓜蟾皮肤的一类抗微生物肽：两种活性形式的分离、表征，以及前体的部分cDNA序列).Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:5449-5453.

Zasloff, M., B. Martin,和H.-C. Chen. 1988. Antimicrobial activity of synthetic magainin peptides and several analogues (合成的瓜蟾抗菌肽及数种类似物的抗微生物活性).Natl. Acad. Sci. USA 85:910-913.

去获取专利，查看全文>