传染性支气管炎病毒SD/04/18株感染鸡体内各组织中病毒的动态分布及排毒规律研究

摘要

禽传染性支气管炎（Avian Infectious Bronchitis，AIB）是由传染性支气管炎病毒（IBV）引起的一种高度接触性传染病。IBV可引起鸡呼吸道、肾脏和生殖道等部位病变，并造成死亡，给养鸡业造成巨大经济损失。IBV不同血清型之间交叉保护性低，新IBV血清型的不断出现给本病的防控带来困难。目前，国内外还没有制定统一的IBV分型标准，但众多学者多采用IBV的S1基因序列分型法。由于不同基因型的IBV在组织嗜性和致病性方面有着较大的差异，因此需要对新分离株进行系统研究，为该病的防控提供依据。 本试验从山东某地疑似患鸡传染性支气管炎（IB）的送检病死鸡中分离到一株病毒，经RT-PCR鉴定及测序分析，确定为IBV并命名为SD/04/18株。根据测序结果，对其S1基因进行遗传分析，发现该毒株与我国主要流行的QX基因型IBV同源性最高。经胰蛋白酶消化液处理的SD/04/18株测得了血凝效价；将SD/04/18株接种8日龄SPF鸡，复制出了与自然感染病例相同的临床症状。为系统性研究IBV SD/04/18株，首先，根据GenBank中已发表的IBV的N基因序列设计引物，建立IBV Real-TimePCR检测方法，该方法最低能检测到39.7copies/μL的病毒核酸；其次，将经典呼吸型IBV-M41标准株与分离的SD/04/18株先通过SPF鸡胚连续传代，再经鸡胚肾原代细胞（CEK）和非洲绿猴肾细胞（Vero）盲传至引起细胞明显病变，同时定量检测每一代次病毒。结果显示，IBV-M41株在CEK原代细胞和Vero细胞上分别传至第4代、第5代时出现明显病变；而SD/04/18株在上述两种细胞上分别传至第5代、第6代时出现明显病变；经连续传代，最终获得能稳定增殖的IBV-M41标准株和SD/04/18分离株。 为探讨SD/04/18株在不同感染阶段对宿主相关器官的病理损伤、组织嗜性、动态分布、排毒规律及宿主抗体水平的影响，进行了下列试验。首先建立IBV SD/04/18株雏鸡感染模型，并在感染后的3d、7d、30d采集气管、肺、肾、脾、胸腺、法氏囊制作病理切片及免疫组化分析；其次，在感染后不同时间点采集12种组织器官进行病毒动态分布检测，同时定期检测感染鸡只的呼吸道和泄殖腔的排毒情况、统计体重及抗体水平。结果显示，不同感染阶段的相同器官病理变化存在差异，感染发病30d时，气管、肺、脾、胸腺得到了很好的恢复，但肾脏和法氏囊病变依然严重；免疫组化法检测到上述器官均有可见抗原聚集；感染后6h，在气管、喉头、肺等部位首先检测到相应载量的病毒，整个过程中，脑、胰脏病毒载量较为稳定，其余各器官的病毒载量整体呈现先增多后减少的趋势；人工感染第1d和第3d分别在呼吸道和泄殖腔检测到病毒核酸，30d时仍能从上述两个部位检出病毒核酸；5d时在被感染鸡群中检测到IBV抗体阳性，抗体滴度峰值出现在感染后27d；感染发病鸡临床症状明显，两组试验鸡体重差异显著。 总之，通过对分离到的QX基因型IBV SD/04/18株的系统性研究，确定了SD/04/18株在临床分型上属肾型IBV。该毒株主要引起发病鸡肾脏病变，对宿主的免疫器官也具有不同程度的损伤，发病鸡排毒时间长，增重慢；靶器官带毒时间长、病毒载量高，各器官病毒载量与宿主抗体水平整体呈现负相关。经过鸡胚、细胞盲传后，SD/04/18株能在体外稳定增殖。以上实验结果，将为抗IBV药物的研究提供理想的动物模型并为后续IBV的相关机制研究提供理论依据和实验素材。

目录

声明

符号说明

1.引言

1.1 鸡传染性支气管炎

1.2 鸡传染性支气管炎病毒病原学研究进展

1.2.1 IBV的病原学简介

1.2.2 IBV的结构蛋白及功能

1.2.3 IBV的非结构蛋白及功能

1.3 IBV的基因型和血清型研究进展

1.3.1国外的IBV基因型和血清型研究进展

1.3.2国内的IBV基因型和血清型研究进展

1.4 IBV的分子遗传变异机制研究进展

1.5 IBV诱导的天然免疫应答研究进展

1.6 鸡传染性支气管炎病毒体外培养研究概况

1.7 鸡传染性支气管炎的诊断技术简介

1.8 鸡传染性支气管炎的防控措施简介

1.9研究目的与意义

2.材料与方法

2.1 实验材料

2.2 主要试剂

2.3 主要仪器

2.4 常用试剂的配制

2.4.6 LB液体培养基的配制

2.4.7 LB固体培养基的配制

2.4.8 氨苄西林固体培养基的配制

2.4.9细胞培养基的配制

2.4.10 1×TE电泳液的配制

2.4.11琼脂糖凝胶的制作

2.4.12 1%红血球的制备

2.4.13 4%甲醛组织固定液的配制

2.5试验方法

2.5.4基因的RT-PCR扩增

2.5.5 RT-PCR产物的纯化回收

2.5.6目的基因的连接、转化

2.5.7重组质粒的提取、鉴定与测序分析

2.5.8 SD/04/18株的S1基因遗传进化分析

2.5.9重组质粒的浓度测定与稀释

2.5.10标准质粒Real-TimePCR扩增

2.5.11 IBV 实时定量 PCR检测标准曲线的建立

2.5.12 SD/04/18株的EID50测定

2.5.13 SD/04/18株的血凝效价测定

2.5.14细胞复苏

2.5.15 细胞传代

2.5.16 鸡胚肾原代细胞的制备

2.5.17 动物回归试验

2.5.18 SD/04/18株体外增殖与细胞病变情况

2.5.19病毒定量检测

2.5.20 SD/04/18株多克隆抗体的制备与特异性验证

2.5.21人工感染发病

2.5.22 病料采集与处理

2.5.23 病理组织切片制作

2.5.24 免疫组织化学法分析

2.5.25 病毒动态分布检测

2.5.26 排毒检测

2.5.27 SD/04/18株人工感染抗体水平检测

2.5.28 数据处理与分析

3.结果与分析

3.1病毒分离鉴定结果

3.2 SD/04/18株的S1基因测序分析结果

3.3重组质粒PCR鉴定结果

3.4 IBV 实时定量PCR检测标准曲线的建立

3.4.1标准曲线的灵敏度

3.4.2扩增曲线的重复性

3.4.3标准曲线的特异性

3.4.4标准曲线相关参数

3.5 SD/04/18株的EID50测定与胚胎发育情况

3.6 SD/04/18株的血凝效价测定

3.7动物回归试验与临床症状

3.8 SD/04/18株致细胞病变结果

3.9 两株IBV体外培养增殖情况

3.10 SD/04/18株多克隆抗体特异性验证

3.11人工感染后的临床症状与剖检变化

3.12病理组织变化

3.13免疫组织化学法分析结果

3.14两组试验鸡的体重差异

3.15各器官不同时间点病毒载量的动态变化

3.16相同时间点各器官病毒载量的比较

3.17 SD/04/18株的排毒规律

3.18 抗体水平检测结果

4. 讨论

4.1SD/04/18株分离鉴定与遗传进化分析

4.2 SD/04/18株实时定量PCR检测方法的建立与应用

4.3 SD/04/18株和M41株的体外增殖分析

4.4 SD/04/18株的致病性与排毒规律

4.5 SD/04/18株在各组织器官的动态分布与宿主抗体水平的关系

5. 结论

参考文献

致谢

硕士期间的主要学术成果