FAdV-4和FAdV-8b分离株感染致病性比较病理学研究

摘要

禽腺病毒（fowl adenovirus，FAdV）是一种无囊膜的双股DNA病毒，属于腺病毒科（Adenoviridae）禽腺病毒属（Aviadenovirus），根据抗原性的差异，被分为3个群（FAdV-Ⅰ～Ⅲ），其中Ⅰ群禽腺病毒FAdV-A又分为5个亚群（A~E）、12个血清型（FAdV-1至11，其中FAdV-8分为a和b两型），FAdV-Ⅰ可引起鸡的心包积液综合征（Hydropericardium syndrome，HPS）和包涵体肝炎（Inclusion body hepatitis，IBH）。HPS由血清4型禽腺病毒（FAdV-4）感染所致，IBH可由FAdV-8b、FAdV-7和FAdV-11多种血清型FAdV引起。HPS与IBH患病鸡的肝脏均表现出血性坏死和核内包涵体形成，两者肝脏病变性质相同，但只有HPS发生鸡心包积液病变并造成发病鸡急性死亡。2015年HPS在中国突然大面积爆发流行，发病鸡群表现20%～70%的死亡率，给养禽业带来了巨大的经济损失。为了探究HPS和IBH致病性的异同，本研究拟对本实验室分离的FAdV-4和FAdV-8b两血清型FAdV的感染致病性进行比较，通过体内外感染试验，对病毒增殖、炎症因子mRNA表达水平和器官、细胞的损伤性反应等进行差异性比较病理学研究。 体内感染实验表明，两种病毒分别通过颈部皮下感染SPF雏鸡，两组感染鸡的临床表现、病毒复制能力、病理学变化等方面有所不同，FAdV-4感染雏鸡表现明显的精神萎靡并发生急性死亡，死亡率达60%；FAdV-8b感染组雏鸡仅表现精神沉郁；通过剖检可以看出FAdV-4引起雏鸡心包腔内胶胨样积液，肝脏斑点状出血、点状坏死，肺脏、脾脏、肾脏、胰腺等器官组织都有不同程度的水肿现象；FAdV-8b感染雏鸡肝脏斑点状出血、点状坏死，但未表现出心包积液病变及广泛性器官组织水肿。病理组织学观察发现，FAdV-4和FAdV-8b均可以引起雏鸡肾脏、胰腺和十二指肠不同程度的炎症反应，法氏囊、胸腺以及脾脏淋巴细胞坏死减少；免疫组化检测发现，FAdV-4和FAdV-8b感染SPF雏鸡的肝脏均表现明显的阳性反应，见病变肝细胞核内棕黄色病毒粒子，但在心脏均未发现阳性病毒粒子；两病毒感染雏鸡的胸腺和法氏囊免疫器官指数前期均低于对照组，而后期免疫器官指数开始升高，在感染后期脾脏的免疫器官指数高于对照组。两病毒相比FAdV-4分离株的致病性强于FAdV-8b。 体外感染实验表明，荧光定量检测发现两种病毒可以在肝细胞、鸡肝癌细胞大量复制，在心肌细胞内FAdV-4少量增殖，FAdV-8b的增殖效率极低。两种病毒都不能在心脏成纤维细胞内增殖；通过对Il1b、Tnfα、Il6和Il8细胞因子的mRNA的表达检测发现，两病毒均可以引起肝细胞、鸡肝癌细胞和心肌细胞不同程度的炎性反应，FAdV-8b在肝细胞、鸡肝癌细胞引起上述四种细胞因子mRNA表达比较明显，FAdV-4在心肌细胞引起较强的炎性反应；FAdV-8b在血清中细胞因子含量比FAdV-4感染组高，两病毒在心肌细胞和心脏成纤维细胞上清中细胞因子含量检测并没有较明显的差异。 通过致病性比较研究显示，两病毒均能对肝脏鸡肝癌细胞具有较强的感染致病性，两者差异不大；FAdV-4在心脏和CM中表现较强的感染致病能力。

目录

声明

符号及缩略词

1 引言

1.1病原学

1.1.1 FAdV分类

1.1.2 FAdV的形态结构和理化特性

1.1.3 FAdV的复制

1.2 FAdV流行病学

1.3 FAdV-Ⅰ感染鸡的临床表现、病理变化

1.3.1临床表现

1.3.2 病理变化

1.3.3 诊断方法

1.4 FAdV感染与免疫反应

1.5 FAdV感染与炎性反应

1.6 禽腺病毒病防控措施

1.7 研究目的及意义

2 材料与方法

2.1仪器与试剂

2.2 试剂配制

2.3 试验方法与步骤

2.3.1 FAdV-4和FAdV-8b的纯化

2.3.2 病毒 TCID50的测定

2.4 动物试验

2.4.1 免疫器官指数测定

2.4.2 干湿重检测

2.4.3 常规石蜡切片方法

2.4.4 免疫组织化学方法

2.4.5 病毒DNA的提取

2.4.6 荧光定量标准曲线的建立

2.4.7 RNA提取

2.4.8 RNA反转录及荧光定量检测

2.5 体外感染试验

2.5.1 LMH细胞复苏

2.5.2 LMH细胞计数

2.5.3 LMH细胞传代

2.5.4 LMH细胞冻存

2.5.5 CM、CF的分离培养及鉴定

2.5.6 病毒在LMH、CM和CF中感染增殖

2.6 感染鸡肝脏和心脏组织的炎症因子检测

2.7 病毒感染LMH和CM的炎症因子检测

2.8 炎症因子含量检测

2.9 统计分析

3 试验结果

3.1 FAdV-4和FAdV-8b对SPF雏鸡致病性比较研究

3.1.1 两病毒感染雏鸡的临床症状

3.1.2 感染鸡均表现典型的剖检病变

3.1.3感染鸡的肝脏和心脏组织病理学变化

3.1.4 其他器官的组织病理学变化

3.1.5 器官水肿病变检测

3.1.6 免疫器官指数检测

3.2两病毒感染致病性研究

3.2.1 两病毒在感染鸡肝脏和LMH细胞内增殖情况

3.2.2两病毒在感染鸡的心脏、CM和CF中增殖表现

3.2.2两病毒感染雏鸡的肝脏和心脏炎症反应

4 讨论

5 结论

参考文献

致谢

攻读学位期间发表论文情况