FAdV-4变异株和非变异株二重荧光LAMP引物组、试剂盒及应用

摘要

本发明公开了FAdV‑4变异株和非变异株二重荧光LAMP检测引物组、试剂盒及应用，所述引物组包括引物1‑1、引物1‑2、引物1‑3、引物1‑4、引物1‑5、引物1‑6、引物2‑1、引物2‑2、引物2‑3、引物2‑4、引物2‑5、引物2‑6、探针引物1‑7和探针引物2‑7。本发明针对FAdV‑4变异株和FAdV‑4非变异株各设计了特异性LAMP引物与两条特异性探针引物，使扩增反应具有很高的特异性，通过优化反应条件后，建立了的LAMP检测方法，检测结果准确可靠、操作简单，适合在基层兽医站和养殖场中进行快速检测，具有较好的应用前景，适合推广。

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种FAdV-4变异株和非变异株二重荧光LAMP检测引物组、试剂盒及应用。

背景技术

FAdV-4属于腺病毒科禽腺病毒属，无囊膜、基因组为线性的双链DNA病毒，是心包积液-肝炎综合征(HHS)的病原。自2015年以来，心包积液-肝炎综合征(HHS)成为中国养禽业一种常见且危害极大疾病，主要发生在3～6周龄的肉鸡群中，由于HHS的高致病性和强传染性可导致发病鸡群很高的死亡率，目前发现鸭和鹅也会感染FAdV-4，宿主的广泛性使FAdV-4的防控工作难度加大。目前研究发现，与国外分离株相比，中国流行的FAdV-4发生了变异，具有新的基因型，并且FAdV-4不同毒株在致病性上也有所不同，中国流行株的致病力更强。遗传进化分析显示，中国分离株与印度分离株亲缘关系较近，表明中国毒株可能由印度分离的毒株演化而来，这更要求我们要加强进出口的防疫检疫工作。

目前已有通过分子生物学技术、血清学技术和其他常规的实验室技术，开发了FAdV-4不同的检测方法，包括病毒的分离鉴定、聚合酶链式反应(PCR)、实时荧光定量PCR(qPCR)、琼脂扩散试验(AGP)、酶联免疫吸附试验(ELISA)等。分离鉴定是诊断感染性疾病的金标准方法，但需要专业的实验室人员操作，并且存在较高的生物危害；PCR和qPCR方法仪器设备昂贵，不适合一些小型养殖场的检测；AGP和ELISA需要制备抗原、操作繁琐，因此上述检测方法在临床诊断中具有一定的局限性。因此，目前需要迫切需要建立一种可用于FAdV-4变异株和FAdV-4非变异株高效、敏感、快速和简便的检测方法。

环介导等温扩增(LAMP)是一种在等温条件下扩增病毒核酸的一种经济、快速、灵敏的方法，不需要特殊的仪器，具有成本低廉和结果可视化等优点。目前，目前还未见有二重荧光LAMP检测方法应用于FAdV-4变异株和非变异株鉴别诊断的报道，如果能够开发一种用LAMP技术检测FAdV-4变异株和非变异株的方法，将非常有利于在基层推广。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种FAdV-4变异株和非变异株二重荧光LAMP检测引物组、试剂盒及应用，具体方案如下：

FAdV-4变异株和非变异株的二重荧光LAMP的检测引物组，引物组包括如SEQ IDNO.1所示序列的引物1-1、如SEQ ID NO.2所示序列的引物1-2、如SEQ ID NO.3所示序列的引物1-3、如SEQ ID NO.4所示序列的引物1-4、如SEQ ID NO.5所示序列的引物1-5、如SEQID NO.6所示序列的引物1-6、如SEQ ID NO.7所示序列的探针引物1-7、如SEQ ID NO.8所示序列的引物2-1、如SEQ ID NO.9所示序列的引物2-2、如SEQ ID NO.10所示序列的引物2-3、如SEQ ID NO.11所示序列的引物2-4、如SEQ ID NO.12所示序列的引物2-5、如SEQ IDNO.13所示序列的引物2-6和如SEQ ID NO.14所示序列的探针引物2-7；

所述探针引物1-7的5’端有FAM基团、3’端有BHQ1基团，探针引物2-7的的5’端有CY5基团、3’端有BHQ2基团。

所述的LAMP的检测引物组在LAMP扩增反应体系中的应用。

进一步地，所述LAMP扩增反应体系为：1-4μL dNTP Mix、2.5μL 10×Bst buffer、1μl Bst DNA聚合酶8U、0.5～2.5μLMgSO

进一步地，所述LAMP扩增反应体系中dNTP Mix终浓度为0.4mmol/L-1.6mmol/L，Bst DNA聚合酶8U终浓度为320U/mL，MgSO

进一步地，所述LAMP扩增反应条件为：在温度60℃反应40分钟，80℃作用5min灭活。

FAdV-4变异株和非变异株的二重荧光LAMP的检测试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1所述的LAMP的检测引物组。

所述的LAMP的检测引物组在制备检测或辅助检测待测样品中是否含有FAdV-4变异株和非变异株的产品或制剂中的应用。

本发明的优点

本发明的FAdV-4变异株和非变异株二重荧光LAMP检测试剂盒，针对FAdV-4变异株和非变异株各设计了特异性LAMP引物与两条特异性探针引物，使扩增反应具有很高的特异性，通过优化反应条件后，建立了的LAMP检测方法。该试剂盒能特异的检测FAdV-4变异株和非变异株，并且检测的灵敏度和检测效率非常高，能检测到100拷贝数的FAdV-4变异株和非变异株样品，具有比常规检测方法更特异、更敏感的特点，而且通过两种荧光的颜色，能实现FAdV-4变异株和非变异株的可视化双重检测，检测结果准确可靠，同时其操作简单仅需使用一台能控温的水浴锅，适合在基层兽医站和养殖场中进行快速检测，具有较好的应用前景，适合推广应用。

附图说明

图1为使用LAMP法检测引物组的特异性结果；

图2为检测系统的灵敏度试验在LAMP实时浊度仪扩增曲线；

图3为检测系统的灵敏度试验在多色荧光成像系统双通道下的结果；

图4为检测系统的灵敏度试验在多色荧光成像系统520nm通道下的结果；

图5为检测系统的灵敏度试验在多色荧光成像系统670nm通道下的结果；

图6为检测系统的干扰性试验在多色荧光成像系统双通道下的结果；

图7为检测系统的干扰性试验在多色荧光成像系统520nm通道下的结果；

图8为检测系统的干扰性试验在多色荧光成像系统670nm通道下的结果。

图9为FAdV-4变异株的引物设计示意图。

图10为FAdV-4非变异株的引物设计示意图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的解释和说明，需要注意的是，本具体实施例不用于限定本发明的权利范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1引物设计

根据GenBank中FAdV-4变异株和非变异株的核苷酸序列，设计LAMP检测引物，包括引物1-1、引物1-2、引物1-3、引物1-4、引物1-5、引物1-6、探针引物1-7、引物2-1、引物2-2、引物2-3、引物2-4、引物2-5、引物2-6、探针引物2-7。

引物1-1的序列如SEQ ID NO.1所示，引物1-2的序列如SEQ ID NO.2所示，引物1-3的序列如SEQ ID NO.3所示，引物1-4的序列如SEQ ID NO.4所示，引物1-5的序列如SEQ IDNO.5所示，引物1-6的序列如SEQ ID NO.6所示，探针引物1-7的序列如SEQ ID NO.7所示，引物2-1的序列如SEQ ID NO.7所示，引物2-2的序列如SEQ ID NO.9所示，引物2-3的序列如SEQ ID NO.10所示，引物2-4的序列如SEQ ID NO.11所示，引物2-5的序列如SEQ ID NO.12所示，引物2-6的序列如SEQ ID NO.13所示，探针引物2-7的序列如SEQ ID NO.14所示；

其中，引物1-7的5’端有FAM基团、3’端有BHQ1基团，引物2-7的的5’端有CY5基团、3’端有BHQ2基团。

实施例2检测FAdV-4变异株和非变异株检测样品和来源见下表：

表1待测特异性试验毒株名称与来源

GVRI：广西兽医研究所；CVCC：中国兽药监察所；UCONN：康涅狄格大学；

2、使用DNA抽提试剂盒从样品中抽提DNA；

3、优化LAMP反应体系、反应条件和试剂盒的构建

首先，建立以下的LAMP反应体系：1-4μL dNTP Mix(10mmol/L，终浓度为0.4mmol/L-1.6mmol/L)、2.5μL 10×Bst buffer、1μl Bst DNA聚合酶8U(终浓度为320U/mL)、0.5～2.5μLMgSO

反应条件：温度按58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃依次递增，反应时间依次按照20min、40min、60min、80min进行优化，80℃作用5min灭活。

分别按照上述的反应体系和反应条件进行摸索，获得下述的最佳反应体系和条件：

3.5μL dNTP Mix(10mmol/L，终浓度为1.4mmol/L)、2.5μL 10×Bst buffer、1μLBst DNA聚合酶8U(终浓度为320U/mL)、2μL MgSO

其中，LAMP反应的条件为60℃反应40分钟，80℃作用5min灭活。

使用多色荧光成像系统观察检测结果，见图1，在520nm和670nm双通道观察，在520nm通道下被标记FAM荧光基团的FAdV-4变异株探针阳性结果反应管中可见绿色荧光、在670nm通道下被标记有CY5荧光基团的FAdV-4非变异株探针在阳性反应管中可见红色荧光。红色荧光。因此当反应管中可见黄色荧光时，说明两个通道都呈阳性，样品中有FAdV-4变异株和非变异株检测样品。

在图1中，各管样品分别为：

样品1:1:FAdV-4非变异株DNA；

样品2:FAdV-1；

样品3:FAdV-2；

样品4:FAdV-3；

样品5:FAdV-5；

样品6:FAdV-6；

样品7:FAdV-7；

样品8:FAdV-8；

样品9:FAdV-4变异株和非变异株DNA

样品10:FAdV-9；

样品11:FAdV-10；

样品12:FAdV-11；

样品13:ILTV Beijing strain；

样品14:NDV F48；

样品15:IBV M41；

样品16:IBDV；

样品17:FAdV-4变异株DNA；

样品18:ARV S1133；

样品19:AIV-H5N2(QT35/87)；

样品20:AIV-H7N2(HK/47/76)；

样品21:AIV-H9N2(220B14/2018)；

样品22:大肠杆菌；

样品23:支原体；

样品24:阴性对照

从图1可以看出，A为520nm荧光通道下，第9和17号样品呈绿色荧光，说明含有FAdV-4变异株样品；B为670nm荧光通道下，第1和9号样品呈红色荧光，说明含有FAdV-4非变异株；C为520nm和670nm荧光通道下，第9号样品呈黄色荧光，说明含有FAdV-4变异株和非变异株样品，这些结果跟样品来源是一致的。

4、灵敏度检测

将FAdV-4变异株和FAdV-4非变异株质粒按照10倍梯度倍比稀释，1×10

结果如图2、3、4、5，图2为LAMP实时浊度仪检测下产生的扩增曲线，图3、4、5为多色荧光成像系统结果，图3为520nm通道下结果，图4为670nm通道下结果，图5为双通道观察结果。其中1：1×10

5、干扰性检测

为了验证高浓度模板是否会抑制低浓度模板的扩增，制备7种不同浓度的FAdV-4变异株和非变异株质粒组合，如下

(1)FAdV-4变异株HA(10

(2)FAdV-4变异株HA(10

(3)FAdV-4变异株HA(10

(4)FAdV-4变异株HA(10

(5)FAdV-4变异株HA(10

(6)FAdV-4变异株HA(10

(7)FAdV-4变异株HA(10

(8)阴性对照

结果见图6、7、8；图6为520nm通道观察结果，7个样品全部呈绿色荧光；图7为670nm通道观察结果，7个样品全部呈红色荧光；图8为520nm和670nm双通道观察结果，7个样品全部呈黄色荧光。由图可知，不同组合的高浓度模板和低浓度模板之间在反应时并不会相互干扰。

序列表

<110> 广西壮族自治区兽医研究所

<120> FAdV-4变异株和非变异株二重荧光LAMP引物组、试剂盒及应用

<130> LWY2021044

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cggctccaac tggtttga 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

caggtcaagc tgggatgc 18

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgggggagta gacgtaaccc tgccgacact gtggtgacga 40

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

acattccgaa aacgggaagc cctctcacca tgcgtttggc 40

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aggaaaaagg gataggaccg g 21

<210> 6

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cggctccaat caagcgc 17

<210> 7

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ggctacgccg agaccgaagc gggaccttcc gcgtagcc 38

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

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<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cggaatcgac atggtgaagg 20

<210> 10

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

agcaggaagg ctcgtatacc ctttagacac gtgacaggtc ca 42

<210> 11

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cgcaccgtca caaaaggtct cggggttaaa gcgtgccgta t 41

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

actatgcttt tgaagtggtg gag 23

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

cctccctaca aatgtcccag t 21

<210> 14

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

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