禽戊型肝炎病毒中国分离株致病性及跨种系感染研究

摘要

戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus，HEV)感染宿主范围广，种类多，变异快。目前已在猪、鸡、兔、骆驼、牛、羊等动物中获得了不同动物HEV分离株。其中禽HEV在患有鸡大肝大脾病(Big liver and spleen disease，BLS)、肝炎脾大(Hepatitis Splenomegaly，HS)综合征、产蛋率下降鸡群以及健康鸡群中均有检出;而且临床病例调查发现禽HEV感染对蛋鸡（母鸡）的危害似乎高于公鸡、对散养鸡群高于笼养鸡群。因此，禽HEV对不同鸡只致病差异仍需要深入研究。此外，已有研究表明猪和兔可能是HEV的自然储存宿主，猪、兔HEV在彼此的自然宿主之间可以相互跨种感染;且二者均可以感染恒河猴预示其具有人畜共患的可能性。禽HEV和猪、兔HEV在遗传性和抗原性有一定的相关性，已有报道禽HEV可以跨种系感染火鸡，但其是否可以跨种系感染哺乳动物仍未见相关报道。
　　因此，本研究系统研究了禽HEV中国分离株（CaHEV）对蛋鸡的致病性，对公鸡、母鸡的致病差异以及在散养、笼养模式下的传播差异;同时以哺乳动物兔为实验动物，设计动物试验初步分析了CaHEV跨种感染哺乳动物的可能性。本研究的主要内容和结果如下:
　　1.CaHEV对鸡的致病性研究
　　1.1CaHEV感染导致蛋鸡产蛋量下降:
　　通过翅静脉和口鼻两种途径分别将相同剂量的CaHEV感染开产蛋鸡。结果显示，未感染（对照）蛋鸡每周产蛋率大约维持在98.6％;经静脉和口鼻途径感染的蛋鸡在感染后第3周和第8周产蛋量分别下降了30％和25％，感染后第12周和第13周产蛋量恢复到对照组水平;经口鼻感染的蛋鸡在感染后第2、3周分别出现病毒血症和抗体转阳，均比静脉接种组晚1周出现，口鼻接种组的肝组织病理损伤比静脉接种组程度较轻。
　　1.2母鸡对CaHEV的感染性高于公鸡:
　　通过静脉途径将相同剂量的CaHEV感染公鸡和母鸡。结果显示，在感染后第4周，10只母鸡均出现了抗体转阳，而10只公鸡中仅有7只出现;母鸡和公鸡均在感染后第1周开始粪便排毒，母鸡粪便排毒维持至第5周，而公鸡维持至第4周;而且，在感染后第1-4周，母鸡出现粪便排毒的鸡只数量分别要比公鸡多3、2、3和1只。
　　1.3散养鸡群对CaHEV易感性高于笼养鸡群:
　　通过对中国传统的两种不同饲养模式（笼养和散养）的鸡群进行抗-禽HEV抗体和RNA检测，结果显示散养型鸡场禽HEV抗体和RNA阳性率分别为54.10％和22.80％，笼养型鸡场分别为12.12％和5.66％。设计动物试验来模拟两种不同饲养模式以排除养殖场地、饲养管理等因素的干扰，进一步验证两种饲养模式对禽HEV在鸡群中的传播差异。结果显示在散养模式下，6只未接种HEV的鸡只通过口鼻途径感染均出现抗体转阳，病毒血症和粪便排毒，其中5只出现了肝组织损伤;在笼养模式下，7只未接种HEV的鸡只均未出现抗体转阳，2只出现粪便排毒，其中1只同时伴有病毒血症和肝组织损伤。
　　2.CaHEV跨种系感染兔研究
　　2.1兔HEV在SPF兔中的检出:
　　应用两种ELISA方法对从中国陕西的某家SPF动物实验中心收集的80兔子血清样品进行HEV抗体检测，其阳性率分别为62.5％和72.5％。通过对收集的52份粪便样品进行HEV RNA检测，其阳性率为46.15％。对获得的两株兔HEV进行全基因扩增，结果分析显示二者的同源性高达90％（命名为CHN-SX-rHEV），与基因3型兔HEV的同源性为78-94％，与基因3型人，猪，野猪和猫鼬HEV的同源性为77-80％。
　　2.2CaHEV跨种系感染兔:
　　以56只兔为实验动物，随机分为4组，14只/组，分别为CaHEV感染组、CHN-SX-rHEV感染组、猪HEV中国山东分离株CHN-SD-sHEV感染组和阴性对照组。通过静脉注射途径将相同剂量的CaHEV，CHN-SD-sHEV和CHN-SX-rHEV分别感染兔子，在感染后第2、4、6、8和10周，每组分别剖杀两只用于病毒RNA和抗体水平等检测，试验结束时（感染后第28周）对每组剩余4只进行剖杀。结果显示(1)在CaHEV组中，剖杀于试验结束时（感染后第28周）的4只兔子均出现粪便排毒和病毒血症，其中1只在感染后第2周丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平升高，第6周出现抗体转阳;序列分析显示CaHEV-兔分离株有12个氨基酸发生突变。回归试验显示CaHEV-兔分离株感染鸡只后的致病性与CaHEV分离株相同;(2)在CHN-SD-sHEV组中，试验结束时剖杀的4只兔子均出现粪便排毒和病毒血症，3只出现抗体转阳，其中2只ALT水平升高;序列分析显示CHN-SD-sHEV-兔分离株有5个氨基酸发生突变。回归试验显示CHN-SD-sHEV-兔分离株感染猪后的致病性与CHN-SD-sHEV分离株相同;(3)在CHN-SX-rHEV组中，试验结束时剖杀的4只兔子均出现抗体转阳、粪便排毒和病毒血症，其中2只ALT水平升高;序列分析显示CHN-SX-rHEV-兔分离株与本源兔HEV的同源性为100％。
　　综上所述，本研究分析了禽HEV中国分离株对蛋鸡的致病性，母鸡和公鸡对禽HEV的易感差异以及在散养和笼养模式鸡群中病毒的传播差异;同时通过动物试验证明了CaHEV可以跨种系感染哺乳动物兔子。本课题为禽HEV致病机制的研究及其防控提供了新的实验依据，并且为禽HEV人畜共患的研究奠定了基础。

目录

论文说明

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 戊型肝炎病毒的研究进展

1．1．1 戊型肝炎病毒病原学研究概况

1．1．2 戊型肝炎的流行概况

1．1．3 人HEV血清学的流行概况

1．1．4 HEV基因型分布

1．1．5 HEV感染的流行病学模式

1．1．6 戊型肝炎作为一种人畜共患病

1．1．7 HEV动物模型的建立

1．1．8 戊型肝炎的临床特征

1．1．9 HEV的预防和控制

1．2 禽戊型肝炎病毒的研究进展

1．2．1 禽HEV病原学概况

1．2．2 禽戊型肝炎的流行情况

1．2．3 禽HEV的致病性

1．2．4 禽HEV衣壳蛋白的抗原特性

1．2．5 禽HEV的人畜共患性

1．3 本研究的目的与意义

第二章 CaHEV感染导致蛋鸡产蛋量下降

2．1 材料

2．1．1 病毒和实验动物

2．1．2 主要试剂耗材

2．1．3 主要仪器

2．1．4 主要试剂配制

2．2 方法

2．2．1 病毒的增殖与定量

2．2．2 动物试验设计

2．2．3 样品的收集和处理

2．2．5 RT-PCR和qRT-PCR检测样品中的禽HEV RNA

2．2．6 PCR产物的克隆测序

2．2．7 病理切片制备

2．2．8 ALT浓度检测

2．2．9 统计学分析

2．3 结果

2．3．1 临床症状和产蛋率评价

2．3．2 血清样品中禽HEV抗体检测

2．3．3 粪便和血清样品中禽HEV RNA检测

2．3．4 粪便和血清样品中病毒载量

2．3．5 血清样品中ALT检测

2．3．6 解剖学和病理学观察

2．4 讨论

2．5 小结

第三章 母鸡对CaHEV的感染性高于公鸡

3．1 材料

3．1．1 病毒和实验动物

3．1．2 主要试剂耗材

3．1．3 主要仪器

3．2 方法

3．2．8 ALT浓度检测

3．2．9 统计学分析

3．3 结果

3．3．1 临床症状

3．3．2 血清样品中禽HEV抗体检测

3．3．3 粪便和血清样品中禽HEV RNA检测

3．3．4 粪便和血清样品中病毒载量

3．3．5 血清样品中ALT检测

3．3．6 解剖学和病理学观察

3．4 讨论

3．5 小结

第四章 散养鸡群对CaHEV易感性高于笼养鸡群

4．1 材料

4．1．1 病毒和实验动物

4．1．2 主要试剂耗材

4．1．3 主要仪器

4．2 方法

4．2．1 临床样品的收集和处理

4．2．2 动物试验设计

4．2．3 动物试验样品的收集和处理

4．2．4 禽HEV抗体检测

4．2．5 禽HEV RNA检测

4．2．6 序列分析

4．2．7 解剖学和病理学观察

4．2．8 统计学分析

4．3 结果

4．3．1 临床样品中禽HEV抗体和RNA检测

4．3．2 动物试验血清样品中禽HEV抗体检测

4．3．3 动物试验血清和粪便样品中禽HEV RNA检测

4．3．4 解剖学观察

4．3．5 病理学观察

4．4 讨论

4．5 小结

第五章 兔HEV在SPF兔中的检出

5．1 材料

5．1．1 质粒和实验动物

5．1．2 主要试剂耗材

5．1．3 主要仪器

5．2 方法

5．2．1 样品的收集和处理

5．2．3 粪便样品中HEV RNA检测

5．2．4 全基因和部分ORF1基因扩增

5．2．5 序列分析

5．2．6 跨种系感染试验

5．3 结果

5．3．1 HEV抗体和RNA检测

5．3．2 兔HEV全基因扩增

5．3．3 兔HEV基因序列比较和进化树分析

5．3．4 兔HEV跨种系感染试验

5．4 讨论

5．5 小结

第六章 CaHEV跨种系感染兔

6．1 材料

6．1．1 病毒和实验动物

6．1．2 主要试剂耗材

6．1．3 主要仪器

6．2 方法

6．2．1 病毒的增殖与定量

6．2．2 动物试验设计

6．2．3 样品的收集和处理

6．2．4 禽，猪和兔HEV抗体检测

6．2．5 禽，猪和兔HEV RNA检测

6．2．6 解剖学和病理学观察

6．2．7 ALT浓度检测

6．2．8 全基因扩增和序列分析

6．2．9 回归试验

6．2．10 统计学分析

6．3 结果

6．3．2 HEV的抗体检测

6．3．3 HEV RNA检测

6．3．4 定量检测血清样品中的HEV RNA

6．3．5 解剖学和病理学观察

6．3．6 血清样品中ALT浓度检测

6．3．7 序列分析

6．3．8 回归试验

6．4 讨论

6．5 小结

全文总结

本研究创新点

参考文献

致谢

作者简介