黑龙江省烟草马铃薯Y病毒和烟草花叶病毒分子株系鉴定及弱毒疫苗有效片段筛选

摘要

烟草是我国重要的经济作物。黑龙江省是我国烟叶主要产区之一，所产烟叶以物理特性好、烟碱含量低等优点著称。马铃薯Y病毒（Potato virus Y，PVY）和烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）是危害黑龙江烟叶生产的主要病毒。PVY侵染烟草后产生花叶和叶脉坏死症状，TMV产生花叶和畸形症状。目前生产上没有高抗PVY和TMV的主栽品种，也缺少有效的抗病毒药剂。交叉保护是防治植物病毒病的有效方法。本文在明确黑龙江烟草PVY和TMV分子株系的基础上，利用已经获得的烟草脉带花叶病毒（Tobacco vein banding mosaic virus，TVBMV）弱毒疫苗筛选防治PVY和TMV的有效片段，并在田间进行了验证。主要结果如下： 1、测定了黑龙江省Harbin和Mudanjiang两个PVY分离物的基因组序列，并进行了一致率、重组、系统发育和选择压力等分析，证明两个分离物均属PVYN-Wi株系。分离物Harbin和Mudanjiang（GenBank登录号分别为MH933741和MH933742）基因组全长均为9699核苷酸。Harbin与Mudanjiang和比利时分离物GBVC26（JQ969039）一致率最高，为98.5%；Mudanjiang与Harbin和GBVC26一致率最高，为98.5%。Harbin是美国分离物Oz和瑞士分离物N-605的重组体，MDJ是美国分离物CW和N-605的重组体。利用全基因组序列构建的系统进化树显示，PVY分离物分为9个株系，Harbin和MDJ均属PVYN-Wi株系。PVY的11个基因均处于负选择，其中核内含体a基因的选择压力最大。 2、测定了黑龙江省HEB1、HEB2和MDJ三个TMV分离物的基因组序列，并进行了一致率、重组、系统发育和选择压力等分析，证明HEB1和MDJ属U1株系，HEB2属Rakkyo株系。分离物HEB1、HEB2和MDJ全长均为6395核苷酸（GenBank登录号分别为MH595919、MH595920和MH595921）。HEB1和MDJ与辽宁分离物Beipiao（HE818412）一致率最高，分别为98.9%和99.6%；HEB2与云南分离物Chuxiong1（HE818417）一致率最高，为97.1%。HEB1是MDJ和HEB2的重组体。在根据全基因组序列构建的系统进化树中，TMV分为3个分子株系，其中HEB1和MDJ均属Ⅰ（U1）株系，HEB2属Ⅱ（Rakkyo）株系。TMV的4个基因均处于负选择，其中衣壳蛋白基因的选择压力最大。 3、筛选到能有效介导对黑龙江PVY和TMV抗性的有效片段。通过比对本文测定的及Genbank中注册的PVY和TMV分离物基因组序列获得保守序列，利用siRNADirect网站筛选可能高效表达siRNA的片段，得到3个针对PVY的片段（PVYF1、PVYF2、PVYF3）和3个针对TMV的片段（TMVF1、TMVF2、TMVF3）。将6个片段分别连接TVBMV弱毒突变体，转化农杆菌感受态GV3101制成单联弱毒疫苗，分别命名为PVY1、PVY2、PVY3、TMV1、TMV2和TMV3。通过农杆菌浸润接种普通烟，15天后挑战接种强毒株系。挑战接种后15天检查结果，PVY2和TMV3两个弱毒疫苗能分别介导烟草对PVY和TMV的抗性。其中，PVY2的保护率为75%，病毒积累量降低89.27%；TMV3可显著减轻TMV的症状，病毒积累量降低67.20%。 4、在山东省临沂市、潍坊市以及黑龙江省哈尔滨市三地烟田测定了弱毒疫苗PVY2和TMV3的交叉保护效果。PVY2和TMV3对黑龙江烟草PVY和TMV的相对防效分别为66.88%和80.74％。PVY2对山东临沂和潍坊烟草PVY的相对防效分别为76.46%和60.71％，TMV3对山东临沂和潍坊烟草TMV的相对防效分别为87.34%和74.40％。

目录

声明

缩略词表

1 前言

1.1 马铃薯Y病毒

1.1.1 粒体形态和基因组结构

1.1.2 分布危害

1.1.3 株系划分

1.2 烟草花叶病毒

1.2.1 粒体形态和基因组结构

1.2.2 分布危害

1.2.3 株系划分

1.3 烟草病毒病的防治

1.4 交叉保护

1.4.1 交叉保护现象

1.4.2 交叉保护机理

1.4.3弱毒疫苗筛选

1.5 本研究的目的及意义

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 毒原

2.1.2 供试植物

2.1.3 菌株与载体

2.1.4 主要试剂及溶液

2.1.5 主要实验仪器

2.2 实验方法

2.2.1 病毒序列扩增及分析

2.2.2 单联弱毒疫苗的构建

2.2.3 弱毒疫苗保护效果测定

3 结果与分析

3.1 黑龙江PVY分离物序列特征及分子株系鉴定

3.1.1 基因组结构

3.1.2 核苷酸和氨基酸一致率

3.1.3 重组结构

3.1.4 系统进化关系

3.1.5 选择压力

3.1.6 遗传分化系数

3.2 黑龙江TMV分离物序列特征及分子株系鉴定

3.2.1 基因组结构

3.2.2 核苷酸和氨基酸一致率

3.2.3 重组结构

3.2.4 系统发育

3.2.5 选择压力

3.3 弱毒疫苗片段筛选及载体构建

3.4 弱毒疫苗室内交叉保护效果测定

3.4.1 弱毒疫苗对PVY的交叉保护效果

3.4.2 弱毒疫苗对TMV的交叉保护效果

3.5.1 弱毒疫苗接种率

3.5.2 对PVY交叉保护效果

3.5.3 对TMV交叉保护效果

4 讨论

4.1 我国烟田PVY分布及株系演化

4.2 PVY Mudanjiang分离物重组位点

4.3 烟草PVY初侵染来源

4.4 TMV株系划分及地理分布

4.5 TMV进化动力

4.6 弱毒疫苗交叉保护效果

5 结论

参考文献

附录

致谢

攻读学位期间发表论文情况