慢病毒介导的过表达Omp25基因对小胶质细胞的影响及其分子机制

摘要

目的：通过慢病毒介导的Omp25基因转染小鼠小胶质(BV2)细胞，观察Omp25蛋白的表达情况，探索布鲁氏杆菌毒力因子Omp25过表达对BV2细胞的炎症反应作用，为进一步揭示0mp25基因在布鲁氏杆菌中枢神经系统感染中的分子致病机制提供理论基础。
　　方法：选取处于对数期生长的BV2细胞，实验分为三组：感染Omp25重组慢病毒过表达载体（LV-Omp25-GFP组）作为实验组，感染慢病毒阴性载体组（LV-GFP组）作为阴性对照组，另设空白对照组。感染72h后：在荧光显微镜下观察荧光表达情况，判断慢病毒转染效率，同时流式细胞仪荧光分选稳定表达绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein，GFP)的BV2细胞，用于以下实验：
　　①电子透射电镜：观察慢病毒感染组及空白对照组细胞结构，观察细胞在感染前后超微结构的变化。
　　②分别提取各组RNA、DNA，半定量逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和Western blot技术检测细胞中Omp25基因mRNA和蛋白的表达水平，从转录水平和蛋白水平验证Omp25表达成功与否。
　　③分别收集LV-Omp25-GFP组、LV-GFP组、空白对照组细胞上清液，用ELISA试剂盒检测细胞炎性因子TNF-α、IL-6、NO的分泌。
　　④NF-κB信号通路特异性抑制剂BAY11-70825um预处理BV2细胞60min后，加入MOI值为50的LV-Omp25-GFP50ul感染BV2细胞，同时设置对照组，72h后收集实验组及对照组细胞及培养上清液，RT-PCR及ELISA检测炎性因子mRNA水平和蛋白水平的表达情况。多组均数间的比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异具有统计学意义。
　　结果：①慢病毒感染BV2细胞72小时后，在荧光倒置显微镜下观察LV-GFP组和LV-Omp25-GFP组荧光显微镜下可见GFP的表达，约有超过85％的细胞发出绿色荧光，空白对照组由于未感染慢病毒，荧光显微镜下未见GFP的表达。
　　②ELISA结果显示，感染72h后，LV-Omp25-GFP组与空白组及LV-GFP组比较差异均有统计学意义（P﹤0.05）,LV-GFP与空白对照组比较无统计学意义（P>0.05）。
　　③定量PCR结果显示：以空白对照组为1进行比较，慢病毒组Omp25基因的mRNA表达水平明显上调，其表达量较空白对照组和GFP组明显上调，差异均具有明显的统计学意义（P<0.01），而GFP组与空白对照组相比，差异无统计学意义(P>0.05)。表明BV2细胞成功过表达Omp25基因。
　　④Western blot结果：LV-Omp25-GFP组较对照组所检测灰度值升高，提示Omp25慢病毒感染BV2细胞后Omp25蛋白成功过表达。
　　⑤电子透射电镜结果显示：LV-Omp25-GFP组较对照组细胞内可见长且丰富的伪足，大量的脂质空泡、髓样小体，线粒体嵴被大量破坏，细胞胞质内有一些大小不等的吞噬泡,其中含多少不等的慢病毒颗粒凝聚，溶酶体增多。
　　⑥BV2细胞用BAY11-7082预处理60min后转染LV-Omp25-GFP，72h收集细胞和培养上清，荧光定量及ELISA分别从mRNA和蛋白水平检测TNF-α、IL-6、NO的表达。
　　结果：显示加入信号通路抑制剂后能够明显抑制Omp25过表达慢病毒诱导TNF-α、IL-6、NO的产生，证明NF-κB信号通路可能参与诱导促炎因子TNF-α、IL-6、NO的产生。
　　结论：建立Omp25慢病毒过表达载体转染BV2细胞的模型，推测BV2细胞通过内吞将Omp25过表达慢病毒颗粒吞噬进入细胞内，改变细胞超微结构，进而影响细胞内环境，可能导致细胞凋亡；Omp25过表达可激活NF-κB信号通路导致BV2细胞促炎因子TNF-α、IL-6、NO分泌增多，其可能是神经型布鲁氏杆菌病的分子机制之一。

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前言

材料与方法

1. 材料

2 试验方法

结果

1.慢病毒转染效率的评估

2.ELISA 检测炎性因子TNF-α、IL-6及NO的分泌

3.RT- PCR 方法分析 Omp25 mRNA 的表达

4. Western Blot检测各组Omp25蛋白表达的水平

5.透射电镜观察LV-Omp25-GFP感染BV2细胞后其超微结构的变化情况

6. NF-κB信号通路对Omp25过表达BV2细胞分泌促炎因子的影响

讨论

结论

参考文献

文献综述:布鲁氏杆菌毒力因子的研究进展

致谢

攻读硕士学位期间发表的学术论文

攻读硕士学位期间参与申报和研究的课题

攻读硕士学位期间参加的学术会议