经血管外膜转染E2F诱饵寡核苷酸预防球囊损伤后动脉内膜增生和血管狭窄的研究

摘要

背景：基因治疗一直是基础与临床研究的热点问题。其涵盖范围甚广，近年来兴起的诱饵(decoy)策略是其重要的组成部分。冠状动脉腔内成形术(percutaneous transluminal cororlary angioplasty，PTCA)是冠心病介入治疗的常用手段，但治疗后的再狭窄问题严重制约着其疗效的发挥。为此，众多学者从不同角度探索了基因治疗防止PTCA术后再狭窄的效果，并取得了很多进展和成果，但截至目前尚无理想的可行性方案。转录因子(trarISCription factor，TF)E2F在细胞生长周期中起主导作用，是诱饵策略中经常选用的靶TF。不同的转染措施显示，转染E2F诱饵寡脱氧核苷酸(简称诱饵寡核苷酸，Oligodeoxynucleotides，ODN)于损伤的血管区域后，可程度不同地抑制局部E2F的活性，阻断其对下游基因的激活，抑制下游基因的表达，减轻局部细胞增殖和内膜增生，从而有效防止再狭窄的发生。但所用转染途径往往存在操作复杂、转染效果较差、维持时间过短和一定的不良反应等问题。为此，进一步探讨更理想的转染方法甚为必要。 目的：以球囊损伤颈总动脉的大鼠为对象，探讨：(1)生物蛋白胶溶解E2F裸硫代磷酸化诱饵ODN的可行性；(2)经血管外膜局部涂抹含E2F诱饵ODN的蛋白胶制剂转染ODN的效果。 方法：将E2F诱饵ODN溶于生物蛋白胶催化剂专用溶剂中，观察其物理性状变化及与主体液反应情况。选取wistar雄性大鼠72只，随即分为6组：假手术组，阴性对照组，单纯应用生物蛋白胶组，错配E2F诱饵ODN组，小剂量诱饵ODN组，大剂量诱饵ODN组，每组12只。假手术组仅手术分离颈动脉，不给予损伤处理;阴性对照组仅损伤颈动脉，不实施其他干预措施；单纯应用生物蛋白胶组在球囊损伤颈总动脉内膜后在血管外膜涂以生物蛋白胶制品；错配E2F诱饵ODN组在球囊损伤颈总动脉内膜后在血管外膜涂以溶解了2001μg错配E2F诱饵ODN的生物蛋白胶；小剂量诱饵ODN组在球囊损伤颈总动脉内膜后在血管外膜涂以溶解了1001μgE2F诱饵ODN的生物蛋白胶；大剂量诱饵ODN组在球囊损伤颈总动脉内膜后在血管外膜涂以溶解了2001μgE2F诱饵ODN的生物蛋白胶。每组动物各在术后饲养l周、2周、3周时处死4只，H—E染色观察局部组织形态学变化；电镜观察细胞形态超微结构的变化；免疫组化检测局部血管组织E2F的蛋白表达情况。 结果：(1)溶解了E2F诱饵ODN的催化剂液物理性状与单纯催化剂液无差别，溶解了ODN的催化剂液与主体液反应速度、成胶后硬度、溶解时相等，与正常反应无明显差别；(2)阴性对照组大鼠颈动脉球囊损伤术后内膜增生显著重于假手术组，术后2周时内膜增生最为显著，明显重于术后3周时(P<0.05)。内膜的增生伴有血管平滑肌细胞(VaSCular smooth muscle cell，VSMC)的迁移和表型改变。增生的内膜及中膜VSMC E2F表达阳性率明显高于假手术组(P<0.01)；术后2周时E2F表达阳性率明显高于术后3周时(P<0.05)，但与术后1周时无显著差别。 (3)经外膜转染诱饵ODN后，血管内膜增生、血管中膜VSMC增生和迁移明显减轻，血管内膜/中膜(I/M)厚度和面积比、E2F表达显著降低，与阴性对照组、单纯生物蛋白胶组和错配诱饵ODN组相比较差异明显(P<0.05或<0.01)，大剂量组效果又明显优于小剂量组，这一效果在用药3周后依然存在。但与假手术组相比，大剂量转染组和小剂量转染组在术后各时点，无论是I/M厚度和面积比，还是E2F阳性表达率仍然明显升高(P<0.05或<0.01)。单纯蛋白胶组和错配诱饵ODN组术后2周时I/M厚度和面积比均明显高于术后l周和3周时(P<0.05或<0.01)；小剂量ODN组术后2周时I/M厚度和面积比明显高于术后l周时(P<0.05或<0.01)，但与术后3周时差异不显著(P>0.05)；大剂量ODN组3个时点I/M厚度和面积比无明显差别(p均>0.05)。 结论：(1)E2F诱饵ODN可安全溶于生物蛋白胶中，并可以此为载体进行转染； (2)血管外膜局部涂抹溶解有诱饵ODN的生物蛋白胶转染诱饵ODN效果良好； (3)E2F诱饵ODN转染可明显抑制E2F的活性和表达水平，抑制球囊扩张损伤后的血管内膜增生。

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