对虾血细胞T7噬菌体展示文库构建及功能基因淘选

摘要

随着现代集约化高密度养殖及养殖规模的扩大，对虾疾病的发生日益频繁和严重。由于目前对对虾免疫防御机制研究的不是很深入，所以对于某些疾病的预防和治疗缺乏有效的措施，给我国对虾养殖业造成了巨大的经济损失。本实验室一直从事对虾免疫相关的研究，为了研究对虾的免疫相关基因及免疫机制，例如：模式识别受体等，本论文应用T7噬菌体展示这种成熟、有效的研究技术，构建了中国对虾血细胞T7噬菌体展示文库，并且使用多种配体和方法进行文库的生物淘选，对获知的有研究价值的基因进行基因克隆和表达的研究。该研究可以为了解对虾免疫机制提供基础资料。主要的研究工作和结果包括： 1．以细菌刺激后提取的对虾血细胞mRNA为材料，构建中国对虾血细胞的T<,7>噬菌体展示文库，并且进行文库扩增，扩增后文库的滴度达到10<'11>pfu/ml。 2．选择不同的配体，包括革兰氏阴性菌细胞、革兰氏阳性菌细胞、脂多糖和几丁质，应用不同的方法进行淘选，淘选3轮后随机挑取数个噬菌斑，用载体引物扩增插入片断，将不同长度的片断克隆入pMD18－T载体进行测序，测序结果进行blast比对分析，获得16个可信度较高的基因片段，包括围食膜蛋白、蛋白质精氨酸N甲基转移酶、钙网蛋白、RNA结合蛋白、核自身免疫精蛋白等，多数基因在对虾中尚没有报道。 3．对用藤黄微球菌为靶标淘选得到的RNA结合蛋白基因进行深入的研究：包括全长基因克隆、用RT—PCR、Northern blot和原位杂交的方法研究该基因在对虾不同组织的表达和分布。结果显示此基因在卵巢中的表达量最高，在刺激后的血细胞、心脏、肝脏、肠等多个组织中此基因的表达上调。 4.用脂多糖为配体淘选得到延伸因子1－α基因片段，克隆此基因的全长，应用RT—PcR和原位杂交，结果证明此基因在刺激后的肝脏、胃和肠的表达高于未刺激的组织中的表达。推测该基因可能与免疫防御有关。

目录

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符号说明

第一章综述

第二章中国对虾T7噬菌体展示文库的构建及滴度的测定

第三章中国对虾血细胞T7噬菌体文库的淘选

第四章RNA结合蛋白基因克隆及表达研究

第五章延伸因-1α(Elongation Factor-1α)基因克隆和表达研究

论文总结

参考文献

致谢

攻读学位期间发表及整理中的学术论文