三氧化二砷诱导胃癌细胞系AGS凋亡及对其STAT3、VEGF表达的影响

摘要

三氧化二砷(arserlic trioxide，As<,2>O<,3>)是我国传统中药砒霜的主要成分，几世纪前人们就应用砷剂治疗多种疾病，目前已在临床得到广泛的应用。20世纪90年代我国哈尔滨医科大学首先用三氧化二砷治疗急性早幼粒细胞性白血病(acute promyelocytic leukemia，APL)取得显著疗效，对复发、难治病例亦有良好疗效，且与维甲酸(retinoic acid，RA)无交叉耐药，亦无骨髓抑制作用，其副作用不明显，经对症治疗后可迅速消失。上海血液研究所发现三氧化二砷可诱导APL细胞凋亡和部分分化。在过去的十多年里，三氧化二砷己被广泛证明是一种治疗急性早幼粒性白血病的有效制剂。最近几年来，国内外对二氧化二砷与肿瘤的研究发展很快，发现三氧化二砷对恶性淋巴系统疾病、白血病甚至实体瘤都有令人振奋的治疗效果。 虽然三氧化二砷应用于临床己取得了很好效果，关于其应用也积累了很多经验，但是，人们对于三氧化二砷治病的分子机制还知之甚少。目前，这方面的研究在国际上愈来愈成为一个热点。进一步的研究发现，三氧化二砷不仅对急性早幼粒细胞性白血病有效果，而且对其他类型的白血病以及其他许多恶性肿瘤都有良好的治疗效果。1996年《Scierice》著文称“这是继ATRA之后又一另人震惊的发现”。大量资料表明，三氧化二砷对多种实体瘤均具有良好的治疗效果，其作用机制主要是通过诱导肿瘤细胞分化、抑制癌细胞增殖和血管生成等多种细胞调节机制治疗癌症。同时通过对相关凋亡基因的调控及对一些信号通路的影响，诱导多种实体瘤细胞凋亡。 近年来肿瘤细胞凋亡的分子机制，特别是信号转导机制的研究日益受到重视。信号转导及转录活化因子(signal trarIsdtmers and activators oftranscription，STAT)是细胞因子和生长因子受体信号的下游效应物。目前在哺乳动物中已鉴定出STAT家族的7个成员，即Stat1，Stat2，Stat3，Stat4，Stat5a，Stat5b和Stat6。此信号通常产生于细胞膜表面的受体，然后传输至细胞核内，STAT在细胞核内与特异性的DNA启动子结合，调节相关基因的表达<'[1-4]>。Stat3(signal transdtlcers and activators of transcription3，Stat3)信号转导子与转录激活子3蛋白是近年来研究异常活跃的转录因子，目前进行的一些有关细胞培养和动物模型实验，已确认Stat3信号途径是多种人类肿瘤干预治疗有效的分子标靶<'[5-8]>。目前国外有关STAT信号传导途径的研究正蓬勃发展，但大部分多集中在恶性血液系统疾病(白血病、淋巴瘤和多发性骨肉瘤)和头颈部肿瘤、乳腺癌和前列腺癌等方面，国内外关于Stat3在消化系统疾病中的研究才刚刚起步，而探讨Stat3与胃癌细胞和组织关系的报道则更少见，因此，发展潜力巨大。血管内皮生长因子(vasctllar endothelial growth factor，VEGF)又称血管通透因子(vascylar permeability factor，VPF)是1989年由Connolly等发现并命名的一种糖蛋白，为血管生成的主要调控因子，是一种强烈的内皮细胞有丝分裂原和促血管生长因子，在肿瘤患者体内主要来源于肿瘤细胞，通过与内皮细胞表面上的特异性受体结合而发挥其生物学活性。血管生成对促进实体瘤生长和血行播散的作用目前已较明确，肿瘤细胞诱导血管生成的能力已被视为其生长、浸润和转移的先决条件，同时血管生成的发生还被认为是肿瘤发生中的关键事件。现已经证明三氧化二砷能够抑制肿瘤细胞血管形成。在VEGF作用于血管内皮细胞发挥促血管生成作用的过程中，浓度为10 ng/ml的VEGF即可效诱导血管内皮细胞Stat3磷酸化<'[9]>。而VEGF在肿瘤细胞内是否遵循血管内皮细胞内的信号传导途径，尤其是Stat3是否参与信号传导，目前尚不明确。胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，在我国其发病率居各类肿瘤的首位，每年约有17万人死于胃癌，几乎接近全部恶性肿瘤死亡人数的1/4，且每年新增胃癌患者2万人以上，是一种严重威胁人民身体健康的疾病。胃癌对放、化疗的敏感性均较低，行胃癌根治手术的病例有30﹪左右复发。因此寻找对胃癌行之有效的治疗方法具有十分重大的意义。 目的：本实验以胃癌细胞系AGS为研究对象，探讨三氧化二砷诱导胃癌细胞凋亡的相关分子机制。并探讨凋亡过程中三氧化二砷对凋亡相关基因p53、bc1-2及细胞周期调控基因p21的影响。研究Stat3信号途径对VEGF表达的影响以及与p53、bc1-2和p21的关系，及其在凋亡与胃癌血管形成调控中的作用。旨在探索三氧化二砷诱导胃癌细胞系AGS凋亡可能的分子机制，为寻找新的有效治疗胃癌的药物提供理论依据。 方法：(1)分别用1、5、10 μmol/L三氧化二砷处理AGS细胞，在培养24、48、72 h后，采用MTT法检测三氧化二砷对该细胞株生长增殖的影响，以不加药组作为空白对照； (2)流式细胞术(FCM)、3’-OH末端标记法(TUNEL)和DNA ladder检测细胞凋亡； (3)FCM和免疫组化法检测Stat3和VEGF蛋白变化；(4)用ELISA法检测不同浓度和时间段细胞培养上清中VEGF表达变化；(5)用RT-PCR检测凋亡过程中凋亡相关基因p-53和bcl-2及细胞周期调控基因p21 mRNA的变化。并检测VEGF和细胞信号通路中Stat3 mRNA的表达变化；(6)Western Blot检测AGS细胞中P-Stat3表达变化。 结果：(1)AGS细胞经三氧化二砷作用后，细胞增殖受到明显抑制，且呈剂量和作用时间依赖关系； (2)FCM检测在细胞周期G<,1>期前出现“亚二倍体”凋亡峰，并呈现浓度依赖关系；细胞周期中G<,2>期细胞增多，G<,1>期细胞减少，S期细胞的比例未发生明显的变化。提示细胞周期明显阻滞于G<,2>/M期。 (3)TUNEL标记发现DNA链的断裂，DNA ladder发现断裂的DNA呈现‘梯形’条带变化； (4)凋亡相关基因p53mRNA表达升高，bcl-2mRNA表达明显降低；细胞周期相关基因p21mRNA表达增高；(5)AGS细胞凋亡过程中，凋亡相关基因Stat3表达下调，VEGF表达下调，其中以10μmol/L浓度的三氧化二砷作用更强。(6)AGS中存在Stat3的组成性激活，且p-Stat3的表达随As<,2>O<,3>浓度增大表达下降。 结论： (1)不同浓度的三氧化二砷抑制胃癌细胞系AGS增殖并诱导凋亡，且与凋亡的程度呈现浓度和时间依赖性。其凋亡发生机制可能与凋亡相关基因p53上调及抗凋亡bcl-2基因的下调密切相关。p21基因表达下调可能是诱导细胞周期阻滞的机制之一。(2)细胞信号途径中Stat3蛋白表达下降，可能作为胃癌细胞AGS凋亡相关基因和细胞周期调控基因的上游基因，抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡和细胞周期的停滞。Stat3还可能作为VEGF的上游基因下调VEGF基因表达，阻止胃癌血管的形成，进而对胃癌血管的形成起到调控作用。 (3)胃癌细胞系AGS中存在Stat3的磷酸化，三氧化二砷通过抑制P-Stat3的表达，诱导AGS细胞凋亡。JAK/STAT信号通路中Stat3的激活与三氧化二砷诱导胃癌细胞系AGS凋亡密切相关。

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