乙肝病毒核心抗原和截短型中蛋白对TRAIL诱导肝细胞凋亡的影响及分子机制研究

摘要

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)在感染肝细胞中极易发生基因片段的整合从而导致病毒在机体内长期存在不易被清除，如今已经成为世界性难题。 目的： 1.探讨HBV核心抗原(HBcAg)对TRAIL诱导肝细胞凋亡的影响及分子机制的研究。 2.探讨截短型中蛋白(MHBs(t))上调TRAIL诱导肝细胞凋亡的分子机制。 方法： 1.HBc的表达对TRAIL诱导凋亡的影响1.1包含HBc基因真核表达载体的构建设计、合成针对HBc基因的特异性引物，以pUC19/3HBV(adr亚型)为模板，PCR扩增获得相应的基因片段。PCR反应产物经酶切定向克隆入真核表达载体pcDNA3.O内，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，经抗性筛选、酶切、DNA测序鉴定获得阳性重组子，并被分别命名为pcDNA-HBc。 1.2稳定表达HBc蛋白肝癌细胞模型的建立pcDNA-HBc及空载体对照pcDNA3.0以阳离子脂质体介导的方式分别转染肝癌细胞BEL7402，SMMC7721。经G418筛选4周后，获得阳性细胞克隆。传代扩增，获得稳定细胞株，并分别命名为BEL7402.HBc、BEL7402-pcDNA3，及SMMC7721-HBc、SMMC7721-pcDNA3细胞。半定量RT-PCR分别检测HBcmRNA的表达，Western blot检测HBc蛋白质的表达。 1.3尾静脉高压注射建立HBc在体内肝细胞表达模型BALB/c小鼠通过尾静脉高压注射法注射pcDNA3.0、pcDNA-HBc、pcDNA-HBV1.1以及pcDNA-HBV1.1+pcDNA-HBc四种不同质粒组合。48h后，免疫组织化学检测小鼠肝组织内HBc的表达，HE染色，血清ALT水平检测肝脏炎症。 1.4 HBe的表达对TRAIL诱导凋亡的影响细胞模型检测：不同浓度TRAIL分别作用BEL7402、BEL7402-pcDNA3、BEL7402-HBc;SMMC772 1、SMMC7721-pcDNA3、SMMC7721-HBc细胞，24h后CCK-8法检测不同浓度TRAIL对各组细胞的生长抑制情况，确定最佳作用浓度。以10ng/mL TRAIL作用于BEL7402各组细胞，24h后TUNEL流式细胞术检测各组细胞的凋亡率；caspase 3活化水平检测试剂盒检测caspase 3活化水平。 以100ng/mL TRAIL作用于SMMC7721各组细胞，24h后TUNEL流式细胞术检测各组细胞的凋亡率。 同时设计合成针对HBc的反义寡核苷酸，TUNEL检测反义封闭BEL7402-HBV1.1细胞中HBc的表达对TRAIL诱导凋亡的影响。另外，TUNEL检测BEL7402-HBx细胞中转染HBc对TRAIL诱导凋亡效应的影响。 动物体内模型检测：尾静脉高压注射法注射pcDNA3.0、pcDNA-HBc、pcDNA-HBV1.1以及pcDNA.HBV1.I+pcDNA-HBc四种不同质粒组合。48h后，TUNEL原位标记法检测各组小鼠模型肝切片中肝细胞凋亡情况。TUNEL流式细胞术检测各组小鼠模型肝细胞凋亡率。 2.HBe的表达影响TRAIL诱导凋亡的机制研究1)胞膜受体水平： 细胞模型检测：半定量RT-PCR分别检测BEL7402、BEL7402-pcDNA3、BEL7402-HBc：SMMC7721、SMMC7721-pcDNA3、SMMC7721-HBc细胞中TRAIL受体mRNA水平的表达，Western blot、流式细胞术检测各组细胞TRAIL受体蛋白质水平的表达。 动物体内模型检测：尾静脉高压注射法注射pcDNA3.0、pcDNA-HBc、pcDNA.HBV1.1以及pcDNA-HBV1.I+pcDNA-HBc四种不同质粒组合。48h后，分别通过免疫组织化学、流式细胞术以及Western blot检测各组小鼠模型中DR5蛋白水平的表达情况。 临床标本检测：取110例慢性乙肝病人血清，分别检测血清中乙肝病毒核心抗原阳性率和血清中sDR5表达。免疫组化检测慢性乙肝患者肝穿刺标本免疫组化检测DR4、DR5的表达。 2)胞浆凋亡通路水平细胞模型检测：Western blot分别检测10ng/mL TRAIL作用24h后，BEL7402、BEL7402-pcDNA3、BEL7402-HBc细胞procaspase3、8、9，Bid的表达水平。 RT-PCR、Westem blot检测各组细胞Bax、FLIP的表达水平。 动物体内模型检测：尾静脉高压注射法注射pcDNA3.0、pcDNA-HBc、pcDNA-HBV1.1以及pcDNA-HBV1.I+pcDNA-HBc四种不同质粒组合。48h后，Western blot检测各组小鼠肝细胞Procaspase 3，8，9及其Bid的表达。 3)基因转录水平HBe对DR5启动子活性的影响： BEL7402-pcDNA3、BEL7402-HBc细胞中同时转染DR5启动子的报告质粒pDR5PF。48h后，采用双荧光素酶报告基因(Dual Luciferase Reporter，DLR)检测系统检测荧光素酶活性。 3.HBe转染前后BELT402肝癌细胞系基因芯片研究稳定转染细胞BEL7402-pcDNA3、BEL7402-HBc经Trizol法提取总RNA。 经RNA纯化与质检，质检合格后RNA送检进行芯片实验。 4.截短型中蛋白上调肝癌细胞凋亡的分子机制Western blot检NBEL7402、BEL7402-pcDNA3及BEL7402-MHBs(t)细胞中ERK2的磷酸化水平。PD98059抑制ERK2磷酸化以后：TUNEL流式细胞术检测BEL7402-pcDNA3及BEL7402-MnBs(t)细胞在TRAIL作用下的凋亡情况； Western blot检NBEL7402-pcDNA3及BEL7402一MIJBs(t)细胞q~procaspase 3、8、9表达情况。 结论： 1.HBc表达可降低TRAIL诱导肝细胞凋亡的敏感性，证实HBc具有抵抗TRAIL，诱导凋亡的生物学活性。 2.HBc的表达可通过抑制DR-5启动子活性来下调DR-5蛋白的表达水平，并且可降低TRAIL传导通路中procaspase 3，8，9、Bid的活化水平，而TRAIL其他受体的表达和胞浆FLIP、Bax蛋白的表达无明显变化。 3.HBc转染前后BEL7402肝癌细胞系基因芯片研究显示：HBc的表达可能与HBV相关肝癌的发生有一定的相关性。 4.MHBs(t)可促使ERK2磷酸化，并且在Mt-IBs(t)上调肝细胞凋亡过程中发挥关键作用。 创新点及意义： 1.本研究分别通过建立稳定转染肝癌细胞模型和硫代反义寡核苷酸封闭的方法，正、反向论证了HBV基因片段HBc在影响TRAIL诱导凋亡中的作用，并率先报道了HBc的表达可下调肝癌细胞对TRAIL诱导凋亡的敏感性，为进一步深入阐明HBV感染相关疾病的发病机制提供实验依据，为临床治疗提供新的靶点。 2.本研究从TRAIL凋亡通路的胞膜受体水平、胞浆凋亡通路水平及线粒体依赖途径和线粒体非依赖途径，深入探讨了HBc影响TRAIL诱导凋亡的分子机制，提出HBc可能通过调节线粒体依赖途径和非依赖途径凋亡信号的传导来影响TRAIL诱导的细胞凋亡。 3.应用尾静脉高压注射法，在小鼠肝细胞内表达HBc基因，并在体内进一步证实HBc的表达可下调TRAIL诱导的肝细胞凋亡，为HBc基因功能的体内研究建立了一种有价值的实验模型。 4.应用双荧光报告载体系统首次提出HBc能够下调DR5启动子活性，为进一步的机制研究奠定基础。 5.首次通过基因芯片的研究，提出HBc的表达与HCC发生的相关性研究是一项很有价值的研究课题。 6.运用肝癌细胞模型率先报道了MHBs(t)可通过活化ERK2分子的表达，从而上调肝癌细胞对TRAIL，诱导凋亡的敏感性，为MttBs(t)在肝细胞凋亡中作用机制的研究奠定基础。

目录

论文说明：符号说明

声明

前言

总体技术路线

第一部分乙肝病毒核心抗原(HBc)对TRAIL诱导肝细胞凋亡的影响及机制探讨

第一章含HBc基因片段真核表达载体的构建及表达

技术路线

材料与方法

结果

讨论

第二章HBc表达对TRAIL诱导肝细胞凋亡影响的体外研究

材料与方法

结果

讨论

第三章HBc表达对TRAIL诱导肝细胞凋亡影响的体内研究

技术路线

材料与方法

结果

讨论

第四章HBc表达抵抗TRAIL诱导凋亡的分子机制研究(体外)

技术路线

材料与方法

结果

讨论

第五章HBc表达抵抗TRAIL诱导凋亡的分子机制研究(体内)

材料与方法

结果

讨论

第六章HBc对DR5启动子活性的调控作用

材料与方法

结果

讨论

第七章临床标本检测HBc与DR5表达的相关性研究

材料与方法

结果

讨论

第八章利用基因芯片分析HBc转染前后基因表达谱的变化

材料和方法

结果

讨论

小结

第二部分乙肝病毒截短型中蛋白【MHBS(t)】影响TRAIL诱导肝细胞凋亡的机制探讨

材料与方法

1.材料

2.方法

结果

1.MHBs(t)增强ERK2的活化

2.抑制ERK2活化可逆转MHBs(t)对TRAIL诱导凋亡的影响

3.抑制ERK2活化可逆转MHBs(t)对凋亡通路分子的影响

讨论

小结

附图(Figures)

参考文献

致谢

博士在读期间发表论文、论著目录及所获荣誉

发表论文一

发表论文二