IL-12，IL-23和IL-17在再生障碍性贫血中的作用

摘要

研究背景 再生障碍性贫血(Aplastic Ahemia，AA)是一种骨髓造血衰竭症，是由化学、物理、生物因素、药物及其他多种原因导致的造血干细胞的数量减少或是功能异常，从而引起外周血白细胞、红细胞和血小板减少的一种综合征。从患者绝大部分为后天获得性，导致从发生的确切原因尚不明了，大多数再障患者无明显诱因，其中约70％患者的机体免疫调节机制紊乱在发病机制中起重要的作用。大量的研究表明，从是一种以造血组织为靶细胞的自身免疫性疾病，细胞介导的免疫损伤可能是再生障碍性贫血的主要发病机制之一，造血衰竭的发生与T淋巴的数量及功能的异常有密切的关系。T细胞是机体免疫系统中的主要效应细胞，它通过对抗原的识别、处理、递呈等作用构成多种细胞因子同多种细胞之间的网络联系，维持机体免疫功能的生理状态。辅助性T淋巴细胞(T helpercell，Th)对于机体的特异性和非特异性免疫，以及对细胞免疫和体液免疫的调节均有重要的作用。Th细胞亚型Th1和Th2之间的平衡是维持机体免疫内环境稳定的基础。据研究报道，再障患者体内Th1细胞处于优势，骨髓中优势表达Th1型细胞因子。Th1细胞及其分泌的细胞因子在再障的发病中起着重要的作用。 白介素-12(Interleukin-12，IL-12)是由p35和p40两个亚基组成的异二聚体，在Th1免疫反应中起关键作用。IL-12主要由单核巨噬细胞和树突状细胞(Dendritic Cell，Dc)产生，通过与受体IL-12R β 1/IL-12R β 2结合发挥作用。IL-12能促进细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T cell，CTL)的细胞毒作用和增强自然杀伤(Nature Killer，NK)细胞的杀伤作用，促进T细胞、NK细胞和CTL的增殖和活化，Th细胞类型的转化，INF(Interferon)-γ、TNF-α(Tumornecrosis factol-α)和IL-6的大量生成，促进Thl反应，增强免疫应答；IL-12在自身免疫性疾病如糖尿病、类风湿性关节炎和克隆氏病等多种Thl细胞介导的疾病中发挥作用。IL-23是一种新发现的细胞因子，它和IL-12一样，也是异二聚体结构，和11-12共用p40亚单位，另一个较小的亚单位为p19，结构上和p35相似。IL-23主要由抗原提呈细胞(antigen presenting cell，APC)分泌，其他的一些细胞如活化的巨噬细胞以及极化的Thl细胞也能产生IL-23。IL-23也通过与受体结合发挥作用，从而诱导Th1细胞的分化以及INF-Y的产生。近期的研究证实IL-23在自身免疫性疾病的发生和维持中发挥了关键的作用。目前IL-23诱导自身免疫性疾病的作用机制还不完全清楚，但大量的研究显示IL-17是其发挥生物学作用的重要效应因子之一。IL-17是IL-17家族的重要成员之一，是重要的促炎症细胞因子，主要由活化的T细胞分泌。它具有多重生物活性，不仅可以诱导中性粒细胞的增殖、成熟和趋化；还可以促进多种细胞产生TNF、IL-1、IL-6、IL-8、粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)等促炎症细胞因子。 环孢素A(Cyclosporine A，CsA)是目前临床上广泛应用的一种免疫抑制剂，主要用于自身免疫性疾病和移植排斥反应的防治。近年来，CsA用于治疗再障、银屑病、系统性红斑狼疮、实验性脑脊髓膜炎等自身免疫性疾病，成为治疗多种自身免疫反应性疾病的常规用药。目前，虽然国内外对CsA的作用机制及其对淋巴细胞的分化及细胞因子产生并分泌的作用均有一些报道，但其确切的研究机制尚不清楚。 IL-12和IL-23均在免疫反应中起到重要的调节作用，两者的表达异常与免疫介导的疾病有关。因此，寻找一种针对这两个因子的药物也许能够用来治疗包括再障在内的免疫性疾病。近年来，针对两者共用亚基的单克隆抗体已经应用于银屑病、克隆性肠病的实验室和临床研究，显示了较好的疗效。IL-12p40mAb是针对IL-12和IL-23共同亚基p40的单克隆抗体，能够与p40亚基结合，从而阻断IL-12和11-23与受体的结合，中和11-12和IL-23的生物学活性。已有一些临床研究表明，这种抗体对某些免疫介导的疾病有治疗作用。 目的： 从基因和蛋白水平研究IL-12和IL-23在再障中的表达以及它们对再障患者Th1和Th2细胞因子产生的影响，IL-17在再障患者中的表达及IL-23/IL-17通路在再障中的作用。环孢素A对再障患者中IL-12和IL-23的产生以及IL-23/L-17通路的影响。IL-12p40mAb对IL-12和IL-23在再障患者中作用的影响，进一步了解再障的发病机制，从而为治疗再障提供一种新的途径。 方法： (1)运用实时定量PCR法检测IL-12p40，IL-12p35和IL-23p19mRNA在再障患者骨髓单个核细胞(BMMNCs)和外周血单个核细胞(PBMCs)中的表达。用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测IL-12和IL-23在再障患者骨髓和外周血上清中的水平。 (2)用密度梯度离心法分离再障患者和正常人的PBMCs，加或不加SAC刺激48小时，ELISA检测培养上清中IL-12和IL-23的浓度。 (3)用密度梯度离心法分离再障患者和正常人的PBMCs，用抗CD3和CD28单克隆抗体刺激的同时加入或不加rIL-12或rIL-23，刺激72小时，ELISA检测培养上清中INF-γ和IL-4的浓度。 (4)运用实时定量PCR法检测IL-17mRNA在再障患者骨髓单个核细胞(BMMNCs)和外周血单个核细胞(PBMCs)中的表达。用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测IL-17在再障患者骨髓和外周血上清中的水平。 (5)用密度梯度离心法分离再障患者和正常人的PBMCs，用抗CD3和CD28单克隆抗体刺激的同时加入或不加rIL-12或rIL-23，刺激72小时，ELISA检测培养上清中IL-17的浓度。 (6)用密度梯度离心法分离再障患者和正常人的PBMCs，在SAC刺激同时加入或不加环孢素A培养48小时，ELISA检测培养上清中IL-12和IL-23的浓度。 (7)用密度梯度离心法分离再障患者和正常人的PBMCs，用抗CD3+CD28单克隆抗体+rIL-23刺激的同时加入或不加环孢素A，刺激72小时，ELISA检测培养上清中IL-17的浓度。 (8)用密度梯度离心法分离再障患者和正常人的PBMCs，用抗CD3+CD28单克隆抗体+rIL-12/rIL-23刺激的同时加入或不加IL-12p40mAb，刺激72小时，ELISA检测培养上清中INF-γ,TNF-α和IL-17的浓度。 结果： (1)再障患者BMMNCs和PBMCs中IL-12p40，IL-12p35和IL-23p19mRNA的表达与正常对照相比均增高， IL-12和IL-23在骨髓上清和外周血上清中的水平也比正常对照组高。 (2)SAC刺激后，IL-12和IL-23在再障和正常人中的表达均增高，并且再障患者的增加显著高于正常人。 (3)多克隆刺激的PBMCs能够产生INF-γ，IL-12和IL-23能够增强INF-γ的产生，并且IL-12的作用较强；与正常对照相比，再障患者的PBMCs能够产生较多的INF-γ。而IL-12和IL-23对对正常对照和再障患者的PBMCs中IL-4的产生则无影响。 (4)再障患者BMMNCs和PBMCs中IL-17mRNA的表达均比正常对照高。IL-17在骨髓和外周血上清中的水平也升高。 (5)多克隆刺激的PBMCs能够产生IL-17，IL-23能够明显增强IL-17的产生，且与正常对照相比，再障患者的PBMCs能够产生较多的IL-17。而IL-12对IL-17的产生无明显影响(6)CsA可抑制体外SAC诱导的PBMCs产生IL-12和IL-23，并且还可抑制IL-23诱导的IL-17的产生。 (7)IL-12p40mAb能够抑制IL-12和IL-23诱导的多克隆刺激的PBMCs产生INF-γ和TNF-α.并且，IL-12p40mAb也能影响IL-23诱导的IL-17的分泌。 结论： 在再障患者中，IL-12和IL-23在基因和蛋白水平都是上调的。再障患者中上调的IL-12和IL-23能够促进INF-γ的产生，从而促进Th1型免疫反应。IL-17在再障患者中的表达也是增高的，rIL-23能够诱导再障患者PBMCs产生IL-17，说明再障患者中上调的IL-23也能通过诱导IL-17的产生从而在再障中发挥作用。CsA可抑制体外SAC诱导的PBMCs产生IL-12和IL-23，并且还可抑制IL-23诱导的IL-17的产生。说明CsA对再障的治疗作用也可能是通过抑制IL-12，IL-23及IL-23/IL-17通路实现的。IL-12p40mAb能够阻断IL-12和IL-23诱导的细胞因子的分泌，从而为治疗AA提供一种新的途径。

目录

论文说明：符号说明

声明

第一部分IL-12和IL-23在再障碍患者中的表达和作用

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

附图

参考文献

第二部分IL-23/IL-17通路在再生障碍性贫血患者中发病中的作用

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

附图

参考文献

第三部分CsA对再障碍患者中IL-23/IL-17通路的影响

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

附图

参考文献

第四部分IL-12p40mAb对IL-12和IL-23作用的影响

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

附图

参考文献

全文总结

展望

致谢

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