新型抗癫痫药对MDR的影响及MDR1逆转剂在癫痫治疗中的应用价值研究

摘要

癫痫（epilepsy）是大脑神经元突发性异常放电导致短暂大脑功能障碍的一种慢性脑部疾患。癫痫的患病率约为5％0，在儿童和青少年期发病率较高。其中大约有25％的癫痫患者对多种抗癫痫药物耐药而发展为难治性癫痫。 目前对于难治性癫痫耐药机制的研究主要集中在3个方面：（1）神经病理学研究发现大部分患者存在AHS（Ammon's horn scelrosis，Ammon's角硬化），其主要表现为海马CA1、CA3、CA4区及齿状回颗粒细胞层存在神经元缺失和反应性胶质细胞增生，近年认为这种改变可能与线粒体的功能失调有关，并参与耐药机制的形成；（2）生理和药理学研究发现药物靶点的变化可以引起药物敏感性的改变，一线抗癫痫药物的主要作用位点是海马区神经元的电压门控通道，同时电压门控钠离子通道的改变是多种癫痫的共同致病机制；（3）免疫学和分子遗传学研究发现多药耐药基因和蛋白参与耐药的形成，这是近年来研究的热点。其中以ATP结合的蛋白质超家族（ATP-Binding Cassette，ABC）运输蛋白研究最多。越来越多的学者认为难治性癫痫的耐药机制与多种药物运输蛋白过量表达而导致的抗癫痫药物不能有效进入脑细胞有关，其中MDR（Multidrug resistance gene，多药耐药基因）及其表达产物P-糖蛋白（P-gp）倍受关注。 有研究表明mdr1在癫痫模型脑中的过度表达可能是由反复癫痫发作引起。但癫痫患者，尤其是难治性癫痫患者需要长期服用抗癫痫药物，抗癫痫药物尤其抗癫痫新药是否对多药耐药基因的表达产生影响已引起学者们的关注，但相关的研究仍较少。 近年学者们对多药耐药基因的研究多以成年大鼠急性期癫痫持续状态为模型，对慢性癫痫及幼鼠模型的研究较少，但许多研究表明，在个体发育的不同阶段，癫痫的产生、维持及对抗癫痫药物的反应亦不尽相同。众所周知，儿童癫痫的发生率远远高于成人。因此，研究抗癫痫药对慢性癫痫幼年大鼠模型海马中mdr1表达的影响，更能贴近临床，从而为临床治疗提供新的依据。 如上所述，多药耐药的主要发病机制是由于多药耐药基因及其表达产物P-gp蛋白在脑组织中的过度表达，导致抗癫痫药物不能有效的进入脑细胞，从而使抗癫痫药物在脑内及神经元内不能达到有效的浓度，是引起癫痫治疗失败的重要原因。因此，逆转多药耐药基因的过表达对于促进抗癫痫药物进入脑内、提高癫痫的疗效将会具有很大的临床应用价值。目前对于多药耐药基因逆转剂的研究主要集中在肿瘤领域，在癫痫领域的研究较少。因此，研究逆转剂对难治性癫痫多药耐药基因的逆转作用将会为难治性癫痫的治疗提供更广阔的前景。 目的: 1.以海人酸致癫痫持续状态后形成的慢性自发性颞叶癫痫幼年大鼠模型为研究对象，探讨多药耐药基因及其表达产物在大鼠海马中的表达及抗癫痫新药拉莫三嗪对其表达的影响。 2.利用海人酸制备的慢性自发性颞叶癫痫幼年大鼠模型探讨左乙拉西坦对多药耐药基因及其表达产物在大鼠海马中表达的影响，从而指导临床用药。 3.探讨多药耐药基因逆转剂盐酸地尔硫卓对癫痫幼鼠海马中多药耐药基因表达的影响。为难治性癫痫的临床治疗开辟新的途径。 4.探讨难治性癫痫患儿外周血中多药耐药基因的表达及多药耐药基因逆转剂氟桂利嗪在小儿难治性癫痫辅助治疗中的作用。 方法: 1.将出生后7d的雄性Wistar大鼠65只随机分为海人酸（kainic acid，KA）组33只和对照组32只，KA组给予KA1mg/kg（浓度0.5mg/ml）腹腔注射，对照组只腹腔注射相同剂量生理盐水。按照Lado幼鼠癫痫发作分级标准，腹腔注射后连续观察8h，癫痫发作达5级以上癫痫持续状态的大鼠若两周后出现自发性反复惊厥发作则为造模成功。 将KA组中造模成功的26只存活大鼠随机分为癫痫未治疗（EP）组13只、癫痫拉莫三嗪治疗（EP+LTG）组13只，对照组随机分为生理盐水（NS）组、生理盐水拉莫三嗪治疗（NS+LTG）组各16只。治疗组均于自发性发作出现一周后给予抗癫痫新药拉莫三嗪治疗8周，然后将所有大鼠断头取海马，用RT-PCR法测定多药耐药基因mdr1a和mdr1b mRNA的表达。 2.选用生后7d（P7）的Wistar大鼠70只，随机分为癫痫观察组38只和正常对照组32只。癫痫观察组给予海人酸KA1mg/kg（0.5ml/kg），腹腔注射致痫，对照组应用相同方法给予相同剂量的生理盐水。待慢性癫痫模型建立后，癫痫观察组随机分为慢性癫痫（EP）观察组13只，慢性癫痫左乙拉西坦治疗（EP+LEV）组15只；对照组分为生理盐水（NS）组和生理盐水左乙拉西坦治疗（NS+LEV）组各16只。治疗组给予左乙拉西坦（80mg/kg）灌胃，治疗8周后，断头取海马，称重，RT-PCR法测定mdr1a和mdr1b mRNA的表达。 3.将出生后7d的雄性Wistar大鼠75只随机分为海人酸组39只和对照组36只，KA组给予KA腹腔注射，对照组腹腔注射相同剂量生理盐水。造模成功后将海人酸组中存活大鼠31只随机分为癫痫未治疗（EP）组10只、癫痫拉莫三嗪治疗（EP+LTG）组11只，癫痫加拉莫三嗪及盐酸地尔硫卓治疗（EP+LTG+D）组10只。对照组随机分为生理盐水（NS）组、生理盐水拉莫三嗪治疗（NS+LTG）及生理盐水拉莫三嗪加盐酸地尔硫卓治疗（NS+LTG+D）组各12只。治疗组均于自发性发作出现1周后给予拉莫三嗪或拉莫三嗪加盐酸地尔硫卓治疗8周，然后将所有大鼠断头取海马，用RT-PCR法测定mdr1a和mdr1b mRNA的表达。 4.应用RT-PCR技术检测MDR1在22例正常健康查体儿童和辅助治疗前后64例难治性癫痫患儿（其中氟桂利嗪组36例，安慰剂组28例）外周血中的表达情况，同时，进行临床疗效和药物不良反应观察。 结果: 1.EP组、EP+LTG组的mdr1a和mdr1b mRNA表达均比NS组明显增高（P<0.001）；EP+LTG组及NS+LTG组的mdr1a和mdr1b mRNA表达分别较EP组及NS组增高，但无统计学意义（P>0.05）。 2.EP组、EP+LEV组的mdr1a和mdr1b mRNA表达明显增高于NS组和NS+LEV，差异有显著统计学意义（P<0.01）； EP组mdr1a和mdr1b mRNA表达高于EP+LEV组，差异有统计学意义（P<0.05）； NS+LEV组与NS组相比，mdr1a和mdr1b mRNA表达有降低的趋势，但无统计学意义（P>0.05）。 EP组大鼠脑重下降15.3％（EP组0.137±0.018g； NS组0.158±0.015g，P<0.01）：EP+LEV与EP组相比，升高8.1％（EP+LEV组0.149±0.013g，EP组0.137±0.018g，P<0.05）； NS+LEV组较NS下降3.3％（NS+LEV组0.153±0.017g；NS组0.158±0.015g，P>0.05）。 3.EP+LTG+D组的mdr1a和mdr1b mRNA表达低于EP组及EP+LTG组（P<0.05），NS+LTG+D组与NS+LTG组及NS组相比无统计学差异（P>0.05）。 4.难治性癫痫组患儿未进行辅助治疗前MDR1mRNA的表达水平明显高于正常对照组（P<0.01）。辅助治疗后，氟桂利嗪组MDR1 mRNA的表达低于安慰剂组（P<0.01），但高于正常对照组（P<0.05）；安慰剂组MDR1 mRNA的表达比正常对照组高1.14倍。与辅助治疗前相比，氟桂利嗪组MDR1 mRNA表达降低（P<0.01），安慰剂组增高（P<0.05）。氟桂利嗪组与安慰剂组治疗有效率分别为55.56％和3.57％。氟桂利嗪不良反应发生率为8.33％。 结论: 1.反复癫痫发作可使癫痫幼鼠海马中mdr1a、mdr1b mRNA表达增加。 2.拉莫三嗪对癫痫及正常幼鼠海马中mdr1a、mdr1b mRNA的表达无明显影响。 3.左乙拉西坦可使大鼠海马多药耐药基因的表达减少，使癫痫大鼠海马的重量增加，但使正常大鼠海马重量减轻。 4.盐酸地尔硫卓可以逆转mdr1 mRNA的表达。 5.检测外周血MDR1 mRNA的表达可以评估难治性癫痫患儿对抗癫痫药物的敏感程度。 6.氟桂利嗪对MDR1mRNA的表达有逆转作用，用于小儿难治性癫痫辅助治疗时，能减轻癫痫的发作，且小剂量氟桂利嗪副作用小，耐受性好。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：符号说明及中英文对照表

声明

第一部分拉莫三嗪对慢性癫痫幼鼠海马中多药耐药基因表达的影响

前言

材料与方法

结果

讨论

结论与创新

附图表

参考文献

第二部分左乙拉西坦对慢性癫痫幼鼠海马中多药耐药基因表达的影响

前言

资料与方法

结果

讨论

结论

创新性和局限性

附图表

参考文献

第三部分MDR1逆转剂在难治性癫痫中的应用价值研究

一、基础研究 盐酸地尔硫卓对癫痫幼鼠海马中多药耐药基因表达的影响

前言

材料和方法

结果

讨论

结论与创新

附图表

参考文献

二、临床研究 多药耐药基因在小儿难治性癫痫外周血中的表达及氟桂利嗪对其表达的逆转作用

前言

对象与方法

结果

讨论

结论

创新性与局限性

附图表

参考文献

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