三氧化二砷及AFP反义表达载体诱导肝癌细胞凋亡的研究

摘要

背景和目的：
　　 肝癌是目前全球最常见的癌症之一，作为一种发病率高、恶性程度高、死亡率高且高转移的癌症，目前尚无切实有效的治疗方法。近年来随着分子生物学技术、免疫学技术及细胞间信号转导研究的进展，越来越多的生物学治疗方法被用于肝癌的治疗，诱导肿瘤细胞凋亡就是其中之一。
　　 三氧化二砷在治疗急性早幼粒细胞性白血病(acute promyelocytic leukemia,APL)方面已取得很好的临床疗效，现在发现其在肝癌等实体瘤的实验治疗中也有较好的作用效果。但目前对不同肝癌细胞细胞株的作用效果有何差异，很少有人进行横向研究比较。
　　 甲胎蛋白(a-fetoprotein.AFP)被认为是人类发现的第一个真正有价值的肿瘤标记物。AFP作为一种免疫抑制性蛋白质，可抑制免疫攻击，促进肝癌细胞生长。基于AFP在肝癌发生发展中的特殊作用，以AFP为靶点的基因治疗一直是相关研究中的热点之一。
　　 本课题以AFP阳性肝癌细胞系HepG2和Hep3B，AFP阴性肝癌细胞系SMMC-7721及正常肝细胞Changliver四株不同的肝癌细胞为研究对象，分别观察ATO对它们的作用效果。同时，构建AFP反义表达载体转染肿瘤细胞系，抑制该基因表达活性，再结合As2O3，观察其协同诱导肝癌细胞凋亡的变化。本研究将化学药物与基因治疗相结合，立足探寻一种新的肝癌治疗方法，并取得了显著效果，此为临床医学实践提供了科学依据。
　　 研究方法
　　 1、三氧化二砷抗肿瘤活性的研究
　　 1)MTT法检测细胞存活率；
　　 2)Giemsa染色检测细胞核的变化；
　　 3)Hochest33324染色检测细胞核的皱缩；
　　 4)流式细胞术检测细胞周期与凋亡；
　　 5)免疫细胞化学检测NF-κB的变化；
　　 2、AFP反向载体转染肝癌细胞的研究
　　 1)AFP表达载体的构建；
　　 2)脂质体法转染AFP表达载体；
　　 3)RT-PCR检测转染前后细胞内AFP mRNA的表达；
　　 4)Western blot检测转染前后细胞中AFP的表达；
　　 5)MTT法检测转染前后细胞的存活率；
　　 6)流式细胞术检测转染前后细胞周期与凋亡；
　　 3、三氧化二砷联合AFP反义表达载体诱导细胞凋亡的研究
　　 1)MTT法测定反义载体和ATO联合作用及ATO单独作用时细胞存活率的变化；
　　 2)流式细胞术检测反义载体转染后ATO作用24小时与pEGFP空载体转染后ATO作用24小时HepG2细胞周期与凋亡率的变化。
　　 研究结果
　　 1、ATO对AFP阳性肝癌细胞HepG2和Hep3B的生长有明显的抑制作用，而对AFP阴性肝癌细胞SMMC-7721及正常肝细胞Changliver的作用效果不明显。
　　 2、ATO作用于HepG2和Hep3B后，出现明显的凋亡特征。而SMMC-7721仅有个别细胞出现凋亡特征，Changliver没有明显的凋亡特征。
　　 3、ATO作用于HepG2和Hep3B后，G0/G1期细胞和凋亡细胞大量增加。SMMC-7721只有G2/M期的细胞比例有所升高，其它各期和凋亡率变化都不大。Changliver则足各个时期变化均不大。
　　 4、ATO作用于HepG2和Hep3B后，凋亡早期NF-κB的表达量增加。
　　 5、反义载体转染HepG2和Hep3B后，AFP-mRNA的量明显降低，AFP蛋白的表达量减少。
　　 6、反义载体转染HepG2和Hep3B后，细胞存活率降低。反义载体转染HepG2后，各时期细胞变化不大，但细胞凋亡率增加。
　　 7、反义载体和ATO联合作用于HepG2和Hep3B与只用ATO处理相比，细胞存活率减少，而对于SMMC-7721和Changliver，细胞存活率变化不大。
　　 8、对于HepG2，与转染空载体后用ATO处理相比，转染AFP反义载体后再用ATO处理时，细胞被大量阻滞在G0/G1期和G2/M期，细胞凋亡率明显增加。
　　 结论
　　 1、研究发现AFP阳性的肝癌细胞HepG2和Hep3B对ATO的敏感性比AFP阴性肝癌细胞SMMC-7721以及正常肝细胞Changliver要强。
　　 2、ATO能够诱导AFP阳性肝癌细胞HepG2和Hep3B发生凋亡，使其细胞周期大部分阻滞在G0/G1期。
　　 3、在三氧化二砷诱导HepG2和Hep3B细胞凋亡的早期伴随着NF-κB的活化。
　　 4、AFP反义表达载体转染AFP阳性细胞后，细胞存活率降诋.凋亡细胞增加。
　　 5、对于AFP阳性细胞HepG2和Hep3B来说，反义AFP载体与ATO联合作用，比某一个单独作用的效果要好。
　　 6、反义AFP载体与ATO联合作用于AFP阳性细胞HepG2后，细胞大量阻滞在G0/G1期和G2/M期，且凋亡率明显增加。

目录

文摘

英文文摘

CONTENTS

符号说明

前言

第一部分： 三氧化二砷抗肿瘤活性的研究

1.1 材料与设备

1.2 实验方法

1.3 实验结果

1.4 讨论

第二部分： AFP反向载体转染肝癌细胞的研究

2.1 材料与设备

2.2 实验方法

2.3 实验结果

2.4 讨论

第三部分： 三氧化二砷联合AFP反向表达载体诱导细胞凋亡的研究

3.1 材料与设备

3.2 实验方法

3.3 实验结果

3.4 讨论

论文总结及展望

参考文献

致谢

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