三聚氰胺、环丙沙星、喹乙醇和己烯雌酚残留的酶联免疫吸附检测法的建立

摘要

近年来,畜牧业得到了迅速的发展,在该过程中兽药和饲料添加剂起了十分重要的作用。但是,兽药的超标使用不可避免的导致了其在动物体内的大量残留,并通过食物链对人体健康造成威胁,蓄积毒性容易导致器官的病变甚至癌变,畜产品的药物残留问题已引起全世界的广泛关注。为了有效地控制动物性产品中的药物残留,结合国内外先进经验和技术,筛选出一套可行的药物残留量的检测方法,对确保经济的高速发展,保障人民身体健康,具有直接的经济效益和广泛的社会意义。
　　 三聚氰胺原是一种化工原料,但因其含氮量高,价格低廉,最近被一些追求经济利益的不法分子用作食品添加剂,以提高食品检测中的蛋白质含量。美国发生的多起宠物猫、狗中毒死亡事件及我国发生的奶制品恐慌事件已引起了人们的高度重视,许多国家已规定了食物中三聚氰胺的最高检出上限,因此亟需建立方便可靠的三聚氰胺的检测方法。
　　 目前,很多国家已经为此而建立了一些药物残留的检测方法。包括理化检测法、微生物检测法和免疫检测法。理化检测法主要包括LC-MS-MS、LC-UV、HPLC、和LC-MS等。该类方法具有特异性好、稳定、准确的优点,可以作为标准方法,但对操作人员要求很高,仪器设备昂贵,笨重,样品前处理复杂、需要大量的溶剂,费力、费时、不易普及,不适合大规模样品的即时检测。微生物检测法虽然对大量样品进行即时检测,但是灵敏度不够高,不能进行准确的定性定量分析。免疫检测法主要包括CL-ELISA、EICA、ELISA等,该类方法克服了以上方法的缺点,是一种方便、灵敏、快速的检测方法,可以满足量样品的即时检测,发展前景广阔。而结合了化学发光分析的酶联免疫吸附检测法(CL-ELISA),有更宽的线性范围,着更高的灵敏度,是酶联免疫吸附检测法的发展趋势。
　　 对于三聚氰胺的研究的检测,分别采用多种方法合成免疫原和包被抗原并制得了相应的抗体,通过不同包被与不同方案的免疫原产生的抗体的交叉测定,用EDC法合成的免疫原与EDC法得到的包被抗原是成功的。用间接竞争化学发光ELISA检测三聚氰胺的抗体,检测结果为:IC50是1.7μg·mL-1,检测限为0.5μg·mL-1,该抗体跟其他结构相似的药物交叉率均很小,用此抗体检测三聚氰胺在牛奶中的添加回收率,批内变异系数范围是4～19％,批间变异系数范围是5～17％,批内回收率范围是89～112％,批间回收率范围是85～105％。
　　 对于环丙沙星的检测,其免疫原与包被抗原均用EDC法制得。其抗体用间接竞争化学发光ELISA检测,检测结果为:IC50是0.7 ng·mL-1,检测限为0.01 ng·mL-1,该抗体除对加替沙星和氧氟沙星交叉率较高外,对其他药物交叉率较小。用此抗体检测环丙沙星在牛奶中的添加回收率,批内变异系数范围是3～20.2％,批间变异系数范围是6～19％,批内回收率范围是73-111％,批间回收率范围是70～112％。
　　 对于喹乙醇及其代谢物,从喹乙醇的还原产物出发,用CDI法和DSC法合成了免疫原及包被抗原,从喹乙醇的代谢物出发,通过EDC法和混酐法合成了免疫原及包被抗原,并分别制得了相应的抗体。
　　 对于己烯雌酚的研究,用BSA和OVA分别合成了己烯雌酚的免疫原和包被抗原,制得抗体的IC50为275 pg.mL-1,检测限为90 pg.mL-1。通过与乙炔基雌二醇、雌激素酮和雌三醇的交叉率试验测定了抗体的特异性,回收率大于79.5％,批内和批间大约相差6％,变异系数小于10％。在鱼虾、肝、饲料和尿液中的添加检测限分别为为600 pg.mL-1,600 pg.mL-1,4800 pg.mL-1、600 pg.mL-1。
　　 通过本课题的研究,成功制备了三聚氰胺、环丙沙星、喹乙醇和己烯雌酚的免疫原和包被抗原,并通过动物免疫得到了相应的抗体,建立了三聚氰胺、环丙沙星和己烯雌酚间接竞争酶联免疫吸附检测法,为最商品化试剂盒的开发打下了良好的基础,为其他药物检测试剂盒的开发开辟了道路。

目录

文摘

英文文摘

符号说明

第一部分 前言

一 三聚氰胺概述及其检测现状

1.1 三聚氰胺简介

1.2 三聚氰胺检测现状

二 环丙沙星概述及其检测现状

2.1 环丙沙星简介

2.2 环丙沙星检测现状

三 喹乙醇类药物概述及其检测现状

3.1 喹喔啉类药物简介

3.2 喹乙醇简介

3.3 喹乙醇检测现状

四 己烯雌酚概述

五 生物免疫检测法-酶联免疫吸附检测法(ELISA)

5.1 ELISA基本原理

5.2 化学发光酶联免疫法(CL-ELISA)

5.3 ELISA的特点

5.4 ELIsA检测类型

5.5 免疫原的制备

六 本研究的目的和思路

第二部分 实验部分

第一章 实验材料

第一节 实验材料与设备

第二章 偶联物的制备

第一节 三聚氰胺偶联物的制备

第二节 环丙沙星偶联物的制备

第三节 喹乙醇偶联物的制备

第四节 己烯雌酚偶联物的制备

第三章 抗体的制备

第一节 多克隆抗体的制备

第二节 单克隆抗体的制备

第四章 抗体检测

第一节 三聚氰胺抗体的检测

第二节 环丙沙星多克隆抗体的检测

第三节 己烯雌酚单克隆抗体的检测

第三部分 结果与讨论

第一章 免疫原的合成与鉴定

第一节 免疫原的合成与鉴定

第二章 抗体的制备过程

第一节 免疫方案

第二节 抗血清的制备与保存

第三章 抗体的检测

第一节 三聚氰胺抗体的检测结果与分析

第二节 环丙沙星抗体的检测结果与分析

第三节 己烯雌酚的抗体检测结果与分析

结论

附图

参考文献

致谢

本人发表的文章和专利

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