芩丹胶囊对血管外膜成纤维细胞TGF-β1/Smad信号转导通路影响的研究

摘要

背景：心血管的重构贯穿于血管内膜损伤后再狭窄、动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)、高血压等多种心血管疾病的发生、发展过程中，是各种病变维持、恶化的病理结构基础。近年来，血管外膜在损伤后血管重构过程中所起的作用得到了空前的关注。研究证明，外膜对血压升高的反应是最敏感的，并且早于血管中膜和内膜，而且外膜的这种变化是高血压血管结构改变的最早征象之一。血管外膜成纤维细胞(Adventitial fibroblasts，AF)在血管损伤后发生增殖、迁移、分泌细胞外基质，是参与血管损伤后新内膜形成和血管重塑的重要内容。转化生长因子β1(Transforming growth factorβ1，TGF-β1)是迄今为止所发现的功能最为复杂的生长因子之一，被公认为是影响AF生物功能最直接，也是最重要的细胞因子。Smad信号通路是TGF-β1的经典下游信号通路，与众多组织如心肌、肝脏、肺及肾脏等的纤维化密切相关。根据Smad在信号转导中的作用可将其分为三类：⑴受体调节型Smad(Receptor activated Smad，R-Smad)，包括Smad1、2、3、5、8，为Ⅰ型受体激酶的底物，在特定的TGF-β超家族成员的信号转导通路中发挥作用；⑵共同介质型Smad(Common Smad，Co-Samd)，主要是Smad4。Smad4被磷酸化后可以与R-Smad形成杂聚体，然后进入细胞核内对靶基因的转录进行调节；⑶抑制型Smad(Inhibitory Smad，I-Smad)，包括Smad6、7，可以阻断R-Smad与受体或与Co-Samd的结合，从而对Smad信号通路发挥负调控作用。RNA干扰(RNA interference，RNAi)是新兴的生物技术，被Science评为2002年十大科学成就之首。RNA干扰是一种由目的基因所对应的小分子双链RNA(Double-stranded，dsRNA)启动的序列特异的基因沉默过程，从而导致相应的mRNA被降解，进而阻断基因的表达。人工合成的siRNA可特异性地抑制哺乳类细胞中内源性或外源性基因的表达，使相应基因保持沉默或休眠状态。SiRNA所诱发的基因抑制具有高效性和高度的序列特异性。本实验通过观察TGF-β1诱导AF生物活性的改变，并用RNA干扰的方法，研究在外膜成纤维细胞增殖、迁移、表型转化和细胞外基质合成中TGF-β1/Smad信号通路的作用机制，且进一步探讨Smad2和Smad3在上述过程中的不同作用。
　　 目的：⑴观察TGF-β1对外膜成纤维细胞增殖、迁移、表型转化和细胞外基质合成的影响。⑵探讨TGF-β1/Smad信号通路在外膜成纤维细胞增殖、迁移、表型转化和细胞外基质合成中的作用机制，并研究Smad2和Smad3在这些过程中的不同作用。
　　 方法：①体外原代成纤维细胞的培养与鉴定：采用组织贴块法体外原代培养大鼠胸主动脉成纤维细胞。大概3-7天可见细胞从组织块周围爬出；SABC法行平滑肌肌动蛋白-α(alpha smooth muscle actin，α-SMA)和波形蛋白(Vimentin)免疫细胞化学染色鉴定。取第3-8代细胞用于实验。②小干扰RNA链的合成、有效浓度的筛选：设计并分别合成3条Smad2和Smad3特异性siRNA，同时合成荧光标记的阴性对照siRNA(FAM-siRNA)1条和Smad2/3非特异性阴性对照siRNA1条。细胞密度达50％-70％时转染FAM-siRNA。转染后荧光显微镜观察荧光阳性细胞，计算转染效率，根据转染效率选择siRNA和Lipofectamine2000最佳转染浓度。③细胞转染和小干扰有效链的筛选：根据Lipofectamin2000的转染步骤，用western-blot检测各组siRNA的干扰效率，进行有效链的筛选。④MTT法检测细胞的增殖能力：接种细胞，按照说明进行细胞转染，24 h后，加入含20 ng/ml TGF-β1的正常培养液，继续刺激24 h。于刺激结束前4 h每孔加入MTT，然后吸弃上清，加入DMSO，比色。⑤Transwell检测细胞迁移能力：应用6孔板transwell小室行体外迁移实验。细胞分组和处理同前，处理过的细胞消化后用DMEM制成细胞悬液，取0.6ml悬液以5×105/ml的密度接种于上室，下室中加入1.5 ml含10％FCS的正常培养基。37℃培养6 h，将上室内侧附着的细胞用湿棉签擦去，固定，伊红和苏木素染色，倒置显微镜下随意取5个视野进行细胞计数(×100)。⑥实时定量PCR检测相关因子mRNA的表达：细胞处理同前，采用Trizol法提取总RNA，并在PCR热循环仪上将RNA逆转录为cDNA。观察基因沉默和TGF-β1处理后，Smad2、Smad3、Smad7、α-SMA、Ⅰ型及Ⅲ型前胶原肽mRNA的表达。采用2-△△Ct方法对mRNA表达进行相对定量分析。⑦Western-blot检测相关因子蛋白的表达：取对数生长期细胞消化计数，转染24 h后，加入TGF-β1孵育24 h，提取蛋白并定量，western-blot检测p-Smad2、p-Smad3、Smad2、Smad3、Smad7、α-SMA、Ⅰ型前胶原肽蛋白表达。⑧统计学处理所有数据资料均采用SPSS16.0进行统计处理。实验数据用x±s表示，组间差异采用one-way ANOVA分析和，检验，P<0.05为差异有统计学意义。
　　 结果：⑴贴壁3-7d后可见细胞从不同的组织块边缘爬出，取第3代细胞，用α-SMA和Vimentin行免疫细胞化学染色，阳性率达100％。⑵SiRNA转染并经TGF-β1刺激后，干扰组Smad2或Smad3蛋白的表达较单纯刺激组下降80％以上。且小干扰具有高度特异性和选择性，即siRNA-Smad3只降低Smad3蛋白的表达，而对Smad2蛋白的表达没有影响，同样siRNA-Smad2只作用于Smad2，而对Smad3蛋白表达没有作用。⑶与正常对照组相比，TGF-β1刺激组增殖显著增强(P<0.01)；Smad2基因被干扰之后，细胞增殖较单纯TGF-β1刺激组减弱(P<0.01)。基因沉默Smad2能显著抑制成纤维细胞的增殖能力。⑷Smad3基因被沉默后，细胞增殖能力较TGF-β1刺激组减弱(P<0.01)。SiRNA介导的Smad3表达下调可以显著抑制成纤维细胞的增殖。⑸SiRNA-Smad2和siRNA-Smad3均能显著抑制成纤维细胞的增殖，但两者差异没有统计学意义(P>0.05)。⑹与正常对照组相比，TGF-β1刺激后细胞迁移能力显著增强(P<0.01)；下调Smad2基因表达之后，细胞迁移较TGF-β1刺激组减弱(P<0.01)。基因沉默Smad2能显著抑制成纤维细胞的迁移能力。⑺Smad3基因被沉默后，细胞迁移能力较TGF-β1刺激组减弱(P<0.01)。SiRNA介导的Smad3表达下调亦可以显著抑制成纤维细胞的迁移能力。⑻SiRNA-Smad2和siRNA-Smad3均能显著抑制成纤维细胞迁移能力，然而两者之间差别无统计学意义(P>0.05)。⑼经TGF-β1刺激后，Smad2、Smad3、α-SMA、Ⅰ及Ⅲ型前胶原mRNA表达均较正常组显著增强(P<0.05或P<0.01)，而Smad7 mRNA表达则无显著差异(P>0.05)。SiRNA介导Smad2表达下调后，与TGF-β1刺激组相比，α-SMA、Ⅰ及Ⅲ型前胶原mRNA表达显著降低，差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)，Smad7 mRNA表达则无显著差异(P>0.05)。⑽Smad3基因被沉默后，α-SMA，Ⅰ及Ⅲ型前胶原mRNA较TGF-β1刺激组减弱，其差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。Smad7 mRNA表达无显著差异(P>0.05)。⑾SiRNA-Smad2和siRNA-Smad3均能显著α-SMA、Ⅰ及Ⅲ型前胶原mRNA表达，但两者之间差别无统计学意义(P均>0.05)。⑿经TGF-β1刺激后，Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3、α-SMA、Ⅰ型前胶原蛋白表达均较正常组显著增强(P<0.01)，而Smad7蛋白表达则无显著差异(P>0.05)。SiRNA介导Smad2表达下调后，与TGF-β1刺激组相比，p-Smad2、α-SMA、Ⅰ型前胶原蛋白表达显著降低，差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)，Smad7蛋白表达则无显著差异(P>0.05)。⒀Smad3基因被沉默后，p-Smad3、α-SMA、Ⅰ型前胶原蛋白较TGF-β1刺激组减弱，其差异具有统计学意义(P<0.01)。Smad7蛋白表达无显著差异(P>0.05)。⒁SiRNA-Smad2和siRNA-Smad3均能显著α-SMA，Ⅰ型前胶原蛋白表达，但两者之间差别无统计学意义(P>0.05)。
　　 结论：①实验中所选用siRNA可以高效并特异地阻断Smad2或Smad3的表达。②TGF-β1对外膜成纤维细胞的增殖有促进作用，Smad2和Smad3信号通路共同参与其中。③TGF-β1促进外膜成纤维细胞的迁移，这一过程需要Smad2和Smad3的共同参与。④TGF-β1诱导成纤维细胞转分化和胶原沉积，是依赖Smad2和Smad3信号转导通路的共同作用。