鞘氨醇激酶1对肝癌耐药细胞生物学特性的影响

摘要

目的：近年来研究表明鞘脂代谢产物是重要的细胞信号转导分子，它们参与肿瘤浸润、增殖及血管生成的调节，其中神经酰胺（Ceramide Cer）及鞘氨醇(Sphingosine SP)和1-磷酸鞘氨醇(Sphingosine1-phospate S1P)的动态平衡决定肿瘤细胞的凋亡和存活，三者之间的平衡受多种酶的严格调控，鞘氨醇激酶1(Sphingosine kinasel，SPK1)的作用最为关键，其催化SP形成S1P,不仅增加促进生长、抑制凋亡的信使S1P，还能减少有促进凋亡作用的Cer、SP。本课题研究利用携带目的基因的重组腺病毒感染肝癌耐药细胞株BEL-FU后对肝癌细胞凋亡、侵袭能力、耐药特性的影响。
　　 方法：病毒包装细胞AD293细胞培养于含10％胎牛血清、100u/L青霉素、100μ/L链霉素的高糖DMEM培养基中，置于37℃、5％CO2孵箱中培养，用0.25％胰蛋白酶消化，倒置显微镜下观察细胞生长状况，扩增并纯化携带野生型SPK1基因(Ad-SPK1WT)和干涉型SPK1基因(Ad-H1-SPK1)的重组腺病毒，以TCID50方法（IU/ml）和快速CPE法(IU/ml)测定腺病毒感染滴度。人肝癌耐药细胞株BEL-FU培养于含10％胎牛血清、100u/L青霉素、100μ/L链霉素、20000ng/L5-FU的1640培养基中，置于37℃、5％CO2孵箱中培养，以0.25％胰蛋白酶消化，倒置显微镜下观察细胞生长状况，采用对数生长期的细胞进行实验。将干涉型SPK1基因(Ad-H1-SPK1)及野生型SPK1基因(Ad-SPK1WT)导入人肝癌耐药细胞株BEL-FU中；用酶活性检测试剂盒测定SPK酶活性，MTT法检测其对肝癌耐药细胞凋亡特性的影响，Transwell法测定其对肝癌细胞侵袭力的影响，western-blot方法检测多药耐药相关蛋白1(MRP1)表达水平的变化。
　　 结果：⑴重组腺病毒扩增并纯化氯化铯密度梯度离心后可获得高度浓缩的腺病毒。⑵重组腺病毒对BEL-FU感染效率的测定及SPK1基因转移以Ad-EGFP评价腺病毒对BEL-FU细胞的感染效率。当MOI=150时可见到几乎满视野的荧光，且对BEL-FU无明显毒作用。⑶SPK酶活性测定利用多功能酶标仪检测标准孔及实验孔，根据数值做标准曲线R2=1，感染携带Ad-SPK1WT基因腺病毒的BEL-FU细胞SPK活性明显强于感染携带Ad-H1-SPK1基因的BEL-FU细胞，三者之间经单因素方差分析P＜0.05，有统计学意义。⑷鞘氨醇激酶对肝癌耐药细胞凋亡特性的影响5-25μmol/1浓度范围的DMS(N，N，-二甲基鞘氨醇)对细胞增殖均有抑制作用，细胞存活率随药物浓度升高而降低。⑸鞘氨醇激酶对肝癌耐药细胞侵袭力的影响携带Ad-SPK1WT基因的BEL-FU细胞的平均侵袭细胞数明显多于携带Ad-GFP的对照组，而携带Ad-H1-SPK1基因的BEL-FU细胞的平均侵袭细胞数明显少于对照组，说明过表达SPK的肝癌细胞侵袭力增强，而干涉SPK则降低肝癌细胞的侵袭力。⑹鞘氨醇激酶对MRP1表达的影响Western blot结果显示：Ad-SPK1WT、对照组及Ad-H1-SPK1均有MRP1的表达，且携带Ad-SPK1WT多于对照组，而携带Ad-H1-SPK1则少于对照组。Ad-SPK1WT、对照组及Ad-H1-SPK1与β-actin的积分密度比值分别为0.94±0.05，0.77±0.07，0.58±0.05，具有统计学意义(P＜0.05)。
　　 结论：①能获得高感染滴度的Ad-SPK1WT腺病毒和Ad-H1-SPK1腺病毒。②携带Ad-SPK1WT及Ad-H1-SPK1的重组腺病毒能高效感染BEI-FU细胞株。③携带Ad-SPK1WT的重组腺病毒感染BEL-FU细胞后增强细胞中SPK活性；携带Ad-H1-SPK1的重组腺病毒感染BEL-FU细胞后降低细胞中SPK活性。④携带Ad-SPK1WT的重组腺病毒感染BEL-FU细胞后降低DMS(N，N，-二甲基鞘氨醇)对肝癌细胞的促凋亡作用；而携带Ad-H1-SPK1的重组腺病毒感染BEL-FU细胞后增强DMS对肝癌细胞的的促凋亡作用。⑤携带Ad-SPK1WT的重组腺病毒感染BEL-FU细胞后增强肝癌细胞的侵袭能力；携带Ad-H1-SPK1的重组腺病毒感染BEL-FU细胞后降低肝癌细胞的侵袭能力。⑥携带Ad-SPK1WT的重组腺病毒感染BEL-FU细胞后MRP1表达量增加；携带Ad-H1-SPK1的重组腺病毒感染BEL-FU细胞后MRP1表达量降低。