耐药整合子细菌在水环境中的散播调查及其多样性分析

摘要

近年来抗生素在临床治疗及畜牧养殖等方面的滥用,造成了巨大的环境选择压力,使得细菌的耐药以至多重耐药问题日益严重,耐药机制日趋复杂,业已成为临床治疗的难题,其耐药机制、耐药基因的广泛传播及转移是近年来国内外研究的热点。
　　 细菌中存在一种能捕获和表达基因的遗传单位-整合子,其在细菌获得耐药机制中具有重要作用。整合子是一种能通过自身编码的整合酶识别、捕获、整合或剪切细胞外游离基因或基因片段,尤其是耐药基因,并使其得以表达的位点特异性重组系统。整合子本身虽无法移动,但其通常位于具有广泛宿主的可移动元件如接合型质粒、转座子、整合型噬菌体等上,随其发生水平基因转移。整合子根据整合酶基因序列的不同通常分为五类。1型整合子在细菌间散播抗药性的作用最为突出和常见,其通常包括5’保守区,3’保守区以及夹在两保守区之间的可变区,在可变区往往整合有多重耐药基因盒。常见的耐药基因盒种类有编码氨基糖苷类抗生素修饰酶的耐药基因:aac,aad,aphA;编码β-lactamases的耐药基因bla;编码氯霉素乙酰转移酶的耐药基因:cat,cml等。
　　 过去对整合子多样性的研究侧重从临床分离的耐药菌株上,尤其是肠杆菌属。然而自然水环境中也存在着丰富的耐药菌,有些是来自于人类或畜类的致病或条件致病菌,它们在水环境条件下相互接触,其携带的耐药基因及相关的遗传元件就有可能发生水平转移,容易产生多重抗药性或重组产生新的抗药基因;然后通过食物链或其它方式感染人类,对细菌感染疾病的治疗有强烈的阻碍作用。
　　 本论文主要从自然废水环境中分离筛选整合子细菌;调查废水中整合子细菌的发生率及其含有的耐药基因盒种类;分析整合子与细菌耐药性在特定种类抗生素的耐药菌株中是否存在显著性差异;发掘、鉴定了一些新型的整合子结构,并从基因水平上分析了细菌的耐药及其转移机制,说明抗菌药物滥用的危害性从而指导抗菌药物的正确使用,防止抗菌药物的滥用。
　　 本研究具体从济南地区医院周边七个自然废水点采集水样,采用膜过滤后富集培养,梯度稀释涂布含有不同种类和浓度的抗菌药物筛选平板,根据菌落特征、药敏试验得到的抗性谱差异等标准筛得无重复耐药菌株247株。以整合酶基因序列的不同检测247株耐药菌株所含整合子类型。
　　 本研究在所筛189株含有1型整合酶的阳性菌株中,检测到41种不同的基因盒,29种不同的1型基因盒阵列,其中鉴定出7种世界尚未报道过的新型基因盒阵列包括:orfⅠ(693bp);aadB-cat-blaoxa-10-aadA1-orfⅡ-unknown(5193bp);catB8-linF(1877bp);aadB-cat-blaoXA-10-aadA1-dfrA1-aacA4(4336bp);art-3-dfrA27(1393bp);dfrA1-aadB-aphA15-catB3-blaoXA-1-aadA15(4797bp);dhfrⅤ-aac(6')-Ⅱ-nit1-nit2-catB3-blaoXA-1(3800bp)。在32株2型整合酶阳性菌株中,检测到6种基因盒,5种2型基因盒阵列,其中3种为新型基因盒阵列:linF-dfrA1-aadA1(2460bp);dfrA1-catB2-sat2-aadA1(2892bp);linF-dfrA1-aadA1-orf441(4297bp)。并且鉴定了通常位于整合子之外的耐药基因种类。接合实验及转化实验验证了整合子及其常见耐药基因的可移动性。
　　 本研究中还发明了一种利用限制性内切酶EcoRⅡ对细菌整合子中基因盒阵列PCR扩增产物进行酶切构建酶切图谱库,通过EcoRⅡ酶切图谱库实现快速经济检测整合子细菌中基因盒阵列的方法。