釉基质蛋白对正常大鼠与糖尿病大鼠颅骨缺损愈合影响的实验研究

摘要

目的:研究证实釉基质蛋白(Enamel matrix proteins,EMPs)可以促进牙周组织包括牙槽骨的再生。本研究的目的是:
　　 1.提取并分析确定乙酸法提取的EMPs是釉原蛋白占优势的釉基质蛋白,便于下一步的研究;
　　 2.探讨EMPs作为生长因子对正常大鼠极量颅骨缺损愈合的影响;
　　 3.探讨EMPs作为生长因子对糖尿病大鼠极量颅骨缺损愈合的影响。
　　 方法:
　　 1.采用乙酸法提取猪发育期牙胚中EMPs,并进行SDS-PGAE电泳分析。
　　 2.选用20只健康雄性Wistar大鼠,随机分为两组,每组10只(第一组左侧颅骨为实验侧,右侧为对照侧;第二组右侧颅骨为实验侧,左侧为对照侧)。水合氯醛腹腔注射麻醉后,于颅顶手术区备皮消毒。在前额做一长约5-6cm的“U”形切口,切开皮肤至颅骨表面,向后翻起“U”形皮瓣,充分暴露手术区。在不损伤硬脑膜的情况下,用球钻在颅骨中线两侧各做一直径5mm的圆形标准极量骨缺损。按对照侧和实验侧分别植入植入物:对照侧100mg/ml PGA(EMPs载体),实验侧10mg/ml EMPs+100mg/ml PGA,严密缝合皮肤。术后青霉素钠连续注射三天,预防感染。观察并记录实验动物的术后反应及生长情况,分别于第4周、第8周过量麻醉法处死大鼠,并进行影像学检查和组织切片观察分析。
　　 3.选用25只健康雄性Wistar大鼠,适应性饲养1周。过夜禁食后,按60mg/kg的STZ腹腔注射诱导糖尿病大鼠模型。1周后测血糖,血糖≥16.7mmol/L者建模成功。诱导中1只大鼠死亡,其余24只随机分为两组,每组12只(第一组左侧颅骨为实验侧,右侧为对照侧;第二组右侧颅骨为实验侧,左侧为对照侧)。随后的颅骨缺损手术、植入物的植入及标本的处理等过程同2,但处死前需测血糖值,血糖≥16.7mmol/L纳入统计。
　　 结果:
　　 1.EMPs分析显示:大部分蛋白质分子量条带位于25KDa以下,优势条带为20KDa、13KDa和分子量更小的区间,其中20KDa的条带含量最高。
　　 2.正常大鼠切口愈合良好,无炎症,无感染,无排异反应。X线片示:术后4周实验侧与对照侧的极量颅骨缺损范围均无明显缩小,但实验侧缺损边界出现模糊现象;术后8周实验侧与对照侧的极量颅骨缺损范围均缩小,实验侧较对照侧缩小的更加明显,缺损大部分被修复。相对骨密度分析均数和标准差分别为:4周时,实验侧31.8±2.9,对照侧25.8±2.85,两者间具有显著性差异(p<0.05):8周时,实验侧39.4±3.3,对照侧28.6±3.2,两者间具有显著性差异(p<0.05)。组织学观察显示:4周时,对照侧疏松纤维结缔组织大量存在,炎症细胞广泛浸润,少量成骨细胞存在;实验侧存在大量致密纤维结缔组织,其内部可见大量成条索状、网状和团块状分布的嗜酸性骨基质沉积,部分区域出现纤维样骨结构;成骨细胞分布广泛,缺损区边界可见部分新骨生成,成骨迹象明显。8周时,对照侧存在大量疏松的纤维结缔组织,炎症细胞仍广泛存在,缺损区边界有部分纤维骨样组织生成,其内有一定量的成骨细胞存在。实验侧有大量骨质形成,部分成网织状,部分成板层状,局部区域形成哈佛氏系统和骨髓样组织结构。
　　 3.糖尿病大鼠偶有精神不振,出现多食、多饮、多尿症状,个别感染死亡。X线片示:术后4周和8周,实验侧与对照侧的极量颅骨缺损范围均无明显的缩小,缺损中心及周边均无明显的高密度影像。相对骨密度分析均数和标准差分别为:4周时,实验侧31.8±6.8,对照侧29.8±6.0,两者间无显著性差异(p>0.05);8周时,实验侧34.6±4.6,对照侧31.7±2.6,两者间无显著性差异(p>0.05)。组织学观察显示:术后4周和8周,对照侧和实验侧均被薄层纤维结缔组织充填,缺损区边界及纤维组织内少见成骨细胞,无新骨形成,亦无明显成骨迹象。
　　 结论:
　　 1.采用乙酸法从猪的牙胚中提取的釉基质蛋白是典型的釉原蛋白占优势的EMPs表现。
　　 2.10mg/ml的EMPs与其载体PGA联合应用可以促进正常大鼠颅骨缺损的愈合,有利于新骨形成。
　　 3.10mg/ml的EMPs与其载体PGA联合应用对糖尿病大鼠颅骨缺损的愈合无明显促进作用。EMPs对糖尿病大鼠颅骨缺损修复的有效浓度和/或作用与否还有待于进一步研究。