高温纤维素酶产生菌的筛选、鉴定及其基因克隆和酶学性质研究

摘要

纤维素是自然界分布最广泛,最廉价的可再生资源,纤维素酶是纤维素生物质转化为直接能源的关键,纤维素酶的研究也是近年来世界范围内的一个热点。
　　 本文从高温堆肥中分离得到了多株纤维素降解菌,其中包括细菌、真菌及放线菌。经过复筛,得到了三株具有优良产酶特性的菌株,并分别进行了鉴定,包括菌株的形态特征、菌落培养特征、系列生化鉴定及16s rDNA分子鉴定,鉴定结果是:菌株W-5为褐色高温双歧菌(Thermobifida fusca),命名为Thermobifidafusca W-5,菌株F-7为白色高温双歧菌(Thermobifida alba),命名为Thermobifidaalba F-7,菌株S-1为青绿色糖单孢菌(Saccharomonospora viridis),命名为Saccharomonospora viridis S-1。对菌株Saccharomonospora viridis S-1的初步研究发现,其有降解木聚糖酶的能力,但纤维素酶活力极低。而Thermobifida fusca W-5和Thermobifida alba F-7均可在CMC平板生成明显的水解圈,证明两者能够产生纤维素酶。使用赫奇逊滤纸培养基对以上两者进行摇瓶培养发现其都有崩解滤纸的能力,初步检测显示二者都具有滤纸酶活,微品纤维素酶活及木聚糖酶活,说明两者纤维素酶系统较齐全,有一定的应用前景。
　　 对菌株Thermobifida fusca W-5发酵粗酶液的酶学性质进行了初步测定,其最适反应pH为5.0-6.5,在pH4-8.5区间内可保持50％以上的酶活力;最适反应温度为70℃,在55℃-85℃之间,可保持50％以上的酶活。高温70℃处理1小时酶活较未处理时变化不大,热稳定性较好。此外该菌产木聚糖酶能力也较强,且其木聚糖酶的耐热性也很好,对该菌产酶培养基进行了初步的碳、氮源种类的优化,使用木糖渣和秸秆粉等天然碳源时,菌株产酶能力较优,酵母粉、尿素和和蛋白胨更利于其生长和产酶。碳氮源种类优化结果显示该菌更倾向利用天然底物,降解天然纤维素能力较强。因此,无论是作为纤维素酶的工业生产菌株,还是直接用于天然生物质降解,Thermobifida fusca W-5都有一定的应用前景。
　　 克隆了菌株Thermobifida fusca W-5的cel9b和cel5b两种纤维素酶基因,并构建了表达载体pET22b-cel9b及pET22b-cel5b,在宿主菌Rosetta(DE3)pLysS中进行了表达研究。Cel9B分子量约为100 kD,最适作用温度为74℃,最适作用pH5.0,在pH5.0-7.0时可保留90％左右的酶活。温度稳定性非常好,70℃处理1小时尚保留85％的酶活。Cel5B分子量约65 kD,最适作用温度约80℃,70℃处理30 min可保留约40％以上的酶活,温度温度性较好,最适作用pH偏酸,但在pH4.5-pH9.0时,可表现70％以上酶活。
　　 根据纤维素酶基因cel9b的结构特点,首先对其进行了部分结构域缺失突变,构建了重组载体pET22b-cel9b-n-cbd-cbd-cd,pET22b-cel9b-cd,pET22b-cel9b-cd-c-cbm,并进行了异源表达。研究了各缺失突变重组酶的酶学性质,结果显示所有缺失突变的酶与原始酶相比最适作用温度有所下降,最适作用pH基本没有变化。Cel9B的N端CBM对其酶活性起关键作用,而两端CBM都缺失的Cel9B-CD不仅分子量小,而且与原始酶的比活差别不大。
　　 针对Cel9B的耐高温和Cel5B的耐碱性质,通过氨基酸序列比对和同源模建分析,分别对两种酶中影响其性质的关键氨基酸位点进行了定点突变,初步探索了两者的耐高温和耐碱性的机理。其中,Cel9B-CD的C715R与C464A突变体最适作用温度下降的结果显示二硫键较其它类型的残基间作用力对蛋白稳定性影响更大;Cel5B的H206S及K202E突变体的最适反应pH碱性偏移的结果显示活性位点中心周围氨基酸性质,电荷分布,空间位阻,氢键网络等均有可能影响酶的酶学性质。