骨髓间充质干细胞和微囊化施旺氏细胞移植促进心梗区治疗性血管新生和改善心功能的研究

摘要

背景：
　　 当前，缺血性心脏病及其并发症的发病率和死亡率仍然维持在较高水平。急性心肌梗死后心功能障碍主要是由于心肌细胞的损失和心肌纤维化造成的左室重构所造成。目前的治疗策略，包括药物治疗、介入治疗和外科手术，不能从根本上改善其病理生理过程，减少并发症的发生。幸运的是，心肌细胞成形术的出现使急性心肌梗死的治疗看到了新的希望。心肌细胞成形术是一种具有发展潜力的细胞治疗方法，即通过向梗死区域植入干细胞从而替代坏死的心肌细胞。其中，骨髓间充质干细胞因其具有取材方便、自身移植无免疫排斥反应、无医学伦理道德争议等优势而成为一种理想的治疗心肌损伤的移植细胞。
　　 移植入心肌的干细胞一方面可以向心肌细胞分化，另一方面也可以在旁分泌、自分泌等的影响下促进心梗区治疗性血管新生，恢复缺血区的再灌注，从而促进心肌重塑，改善心功能。然而，无论在动物试验还是临床实验上，骨髓间充质干细胞移植只能部分地改善梗塞后心脏的心功能，其原因之一可能为周围的微环境中缺乏持续分泌的促血管生长各种因子如VEGF、TGF等。
　　 以往研究表明神经和血管相伴行，近来进一步的研究探讨了其中的分子机制。在小鼠胚胎肢体皮肤上，小动脉而不是静脉特异性地与外周感觉神经伴行，外周感觉神经或施旺氏细胞地缺失可以导致小动脉生成障碍，同样在体外共培养时，这些细胞的存在也可以诱导胚胎内皮细胞表达动脉标志物，其原因推测是施旺氏细胞分泌的VEGF能够介导胚胎内皮细胞的动脉化。同样在体外实验证明，高浓度的VEGF能促进间充质干细胞向动脉样的内皮细胞分化，低浓度的VEGF则可以上调静脉内皮的标志物。因此施旺氏细胞在血管的动脉样分化和成熟中具有重要作用。施旺氏细胞能大量持续分泌生长因子VEGF、TGF、PDGF等和各种生物活性物质以及分泌基质，是天然的生长因子之“库”。因此我们推测在不仅仅是高浓度的VEGF在间充质干细胞的内皮分化过程中起作用，可能还有许多其它因子也参与了其中的调节，所以我们设计在心梗区的治疗性血管新生中直接引入施旺氏细胞。
　　 然而同种异体的施旺氏细胞具有较强的抗原性，移植后很快被宿主的免疫系统识别而发生急性甚至超急性的排斥反应，严重制约了其在细胞移植中的应用，而微囊化技术正是细胞移植中是实现免疫隔离的极佳手段。微囊膜具有选择性通透功能，允许氧气、营养物质和一些具有生物活性的小分子物质自由出入，而阻止免疫细胞和大分子抗体透过半透膜，从而实现其免疫隔离功能。
　　 研究目的:
　　 我们设计通过联合移植骨髓间充质干细胞和微囊化施旺氏细胞在心梗区域，通过施旺氏细胞持续分泌的生长因子和各类营养物质来促进骨髓间充质干细胞的存活和转化，提高心梗区的治疗性血管新生，从而改善心功能。
　　 研究方法:
　　 一、骨髓间充质干细胞的分离培养
　　 将从SD大鼠股骨、胫骨得到的骨髓以全骨髓培养法种植到塑料培养瓶内，置于37℃、含5％CO2的潮湿培养箱中培养。培养液是含10％胎牛血清的α-MEM，培养液中加入青霉素(100IU/mL)和链霉素(100μg/mL)。接种后24-48小时初次换液，去除其它非贴壁细胞，不需冲洗，动作尽量轻柔，以免将附着于瓶底的半贴壁细胞洗掉。之后每2-3天更换次培养基，12-14天后传代。细胞行流式细胞检验。P3代细胞用于移植，移植前72小时BrdU标记细胞。
　　 二、施旺氏细胞的分离培养及鉴定
　　 无菌条件下取出生1-3天SD大鼠坐骨神经，剥去外膜，剪成0.5-1mm小块。置于37℃培养箱，0.25％胰蛋白酶和0.125％胶原蛋白酶消化15分钟。离心后种植在多聚赖氨酸铺瓶的培养瓶内于37℃、含5％CO2的潮湿培养箱中培养。培养液是含10％胎牛血清的DMEM/F12，培养液中加入青霉素(100IU/mL)和链霉素(100lg/mL)。24小时后加入阿糖胞苷(5μg/ml)处置3天，以去除成纤维细胞。换液后全培养液加入碱性成纤维细胞生长因子(20ng/ml)和福司柯林(4μM)促进增殖。7-8天传代。常规制备细胞爬片，固定后行S-100免疫荧光染色，并计数阳性细胞。
　　 三、微囊化施旺氏细胞制备及分泌活性测定
　　 对数生长期的施旺氏细胞收集后，用1.5％海藻酸钠溶液重悬，制备成细胞终浓度为4×106ml-1细胞悬液。用0.4mm注射器在微囊发生器产生的4000伏静电场下滴入100mM氯化钙溶液内形成海藻酸钙微珠。20分钟后收集微珠，置于0.05％多聚赖氨酸溶液中成膜。0.15％海藻酸钠中和后，用55mM枸橼酸钠水化内核，获得施旺氏细胞微囊。施旺氏细胞微囊置于37℃、含5％CO2的潮湿培养箱中常规培养。部分隔日换液，收集上清，用酶联免疫吸附测定试剂盒测定分泌的VEGF含量。同法制备空白微囊。
　　 四、大鼠心梗模型的制备及骨髓间充质干细胞和微囊化施旺氏细胞的移植
　　 结扎前降动脉方法制作大鼠心梗模型，确认心梗后，使用29G注射器将BrdU标记的骨髓间充质干细胞和/或微囊化施旺氏细胞注入心梗组织周围。动物模型分为五组:微囊化施旺氏细胞+骨髓间充质干细胞(n=10)，空白微囊+骨髓间充质干细胞(n=9)，骨髓间充质干细胞(n=8)，微囊化施旺氏细胞(n=9)以及空白对照组(n=10)。
　　 五、移植后心功能的评定与心梗面积的测量
　　 存活大鼠分别在3天、2周、4周麻醉后行超声心动图检查。测量左室收缩膜内径、左室舒张末内径，并计算左室短轴缩短率。4周后处死大鼠，取出心脏，沿短轴切为1mm心肌组织片。置于2％TTC溶液37℃孵育30分钟，拍照并分析。
　　 六、移植后间充质干细胞生存率的计算与梗死区新生血管密度的测定
　　 梗死区域组织固定包埋后，切片。兔抗大鼠BrdU单克隆抗体行免疫荧光检测，随机视野计数阳性细胞，分组进行统计学分析，测定充质干细胞生存率。兔抗大鼠vWF单克隆抗体行免疫组化检测，随机视野计数新生血管数量，分组进行统计学分析，测定新生血管密度。
　　 七、移植后心肌组织内vWF和VEGF表达量的测定
　　 应用Westernblot技术，检测组织中vWF和VEGF表达情况。
　　 结果:
　　 一、施旺氏细胞鉴定、施旺氏细胞微囊分泌活性测定
　　 分离纯化的施旺氏细胞经免疫荧光测定，S-100阳性表达率超过95％。
　　 微囊内施旺氏细胞能存活，并随着增殖，其分泌的VEGF逐渐增加，8天后达到813.43±86.50pg.ml-1/48h，与没有微囊化的施旺氏细胞821.65±83.30pg.ml-1/48h无统计学意义。说明徽囊膜不会影响VEGF的进出。
　　 二、心功能与心梗面积
　　 超声心动图检查显示，心梗后左室短轴缩短率减小，左室收缩膜内径、左室舒张末内径逐渐增大。但移植后4周，联合移植微囊化施旺氏细胞+骨髓间充质干细胞组左室短轴缩短率减小，左室收缩膜内径与左室舒张末内径逐渐增大的趋势较其他组小(P＜0.01)。空白微囊+骨髓间充质干细胞、骨髓间充质干细胞组虽然也有改善，但较联合移植组统计学差异小。同样，心梗面积联合移植组最小，统计学差异显著(P＜0.01）。
　　 三、骨髓间充质干细胞生存率
　　 在所有移植有骨髓间充质干细胞的组别中，均发现BrdU阳性细胞。其中微囊化施旺氏细胞+骨髓间充质干细胞组最多，有显著统计学意义(13.71±2.14，12.95±1.92vs.20.79±2.89/HPF,P＜0.01)。
　　 四、新生血管密度
　　 实验结果显示四组治疗组新生血管密度均较对照组增加。其中以联合移植组增加明显，有显著统计学差异（P＜0.01）。同时，微囊化施旺氏细胞较空白微囊+骨髓间充质于细胞、骨髓间充质于细胞组增加(P＜0.05)。
　　 五、心肌组织内vWF和VEGF表达
　　 联合移植组心肌组织内vWF和VEGF表达均较其他组增加(P＜0.01)，说明新生血管的增加与VEGF有关。
　　 结论及意义:
　　 实验结果显示，联合移植骨髓间充质干细胞和微囊化施旺氏细胞能存进心梗区域的血管新生，改善心功能。联合移植具有协同效应。对急性心肌梗死的治疗提供了新的思路。