口服雷帕霉素抑制mTOR对防止支架内再狭窄作用的分子机制的实验研究

摘要

冠心病(coronaryheartdisease，CHD)严重威胁现代人的健康，带来沉重的社会公共卫生负担。根据世界卫生组织2006年公布的统计数据，在全世界15-60岁人群的死因中，脑卒中和冠心病分列第五和第二位。根据我国卫生部公布的数据，2005年中国城市居民冠心病死亡率为46.3/10万。冠心病的病因尚不完全清楚，研究显示冠心病为多种危险因素作用所致，包括血脂异常、男性、年龄、高血压病、糖尿病、肥胖、体力活动减少、吸烟、家族史等。冠心病的症状常出现于40岁以上的中老年人，致死性心肌梗死的患者中约80％是65岁以上的老年人。目前冠心病的治疗主要包括药物治疗、经皮冠状动脉介入治疗(Percutaneouscoronaryintervention，PCI)和冠状动脉旁路移植术(Coronaryarterybypassgrafting，CABG)。PCI术于世纪七十年代末首次应用于临床，1984年，我国成功进行了第一例PTCA术，经过近几十年的发展，PCI术由最初的单纯球囊扩张发展到后来的裸金属支架(Barementalstent，BMS)植入，直至现今被广泛应用的药物洗脱支架(Drugeluntingstent，DES)，随着技术的进步与新设备、新器械的不断问世，PCI术现已成为冠心病治疗中较为成熟的手段之一。
　　 多中心随机临床试验已证实:冠状动脉药物洗脱支架能显著减少内膜增生和再狭窄发生率（术后5年内约9％～10％），改善症状，提高生活质量。尽管药物涂层支架(DES)的广泛应用显著降低了PCI术后再狭窄的发生，但是其却增加了支架相关血栓的发生率，如雷帕霉素涂层支架，在抑制血管平滑肌细胞增生的同时也造成了植入支架的内皮细胞修复延迟，容易形成血栓。同时，所有接受DES植入的患者需要接受至少12个月的双联抗血小板治疗，增加了术后出血的风险。
　　 mTOR是哺乳类动物细胞表达的一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。研究发现，mTOR通路激活参与了动脉粥样硬化的发生与发展，与炎症反应、脂代谢紊乱存在协同作用。mTOR信号通路调控异常与动脉粥样硬化的发生密切相关，而传统的mTOR抑制剂主要是雷帕霉素及其衍生物，雷帕霉素能抑制与单核细胞/巨噬细胞有关的细胞因子的产生，包括MCP-1与IL-6。Suzuki等发现雷帕霉素能有效减低MCP-1mRNA水平。Basso等发现，应用雷帕霉素具有独立于降低胆固醇影响之外的抑制动脉粥样硬化进程的作用。
　　 血管内超声成像技术(IVUS)是近几年发展起来的新型影像学技术，在冠脉介入手术中的价值已日益显著，由于其能精确的显示粥样硬化斑块的性质及血管壁的图像，能够准确判断支架贴壁与否以及支架后再狭窄的情况，已成为冠心病诊断与治疗中的重要辅助手段之一，在认识到口服雷帕霉素对斑块的积极作用后，我们希望借助血管内超声技术，评估口服雷帕霉素配合金属裸支架治疗减少再狭窄的效果。
　　 同时，在组织学及病理学方面，我们应用免疫组织化学技术、透射电镜技术、检测了靶血管组织的α-actin，mTOR，胶原，脂质等各项指标，以探求BMS植入加口服雷帕霉素能否达到与DES植入类似的效果，若此法可行，那么将为经皮冠状动脉介入治疗术提供一种全新的方案，在预防支架内在狭窄的同时，还可以降低支架内血栓发生率，并减少术后双联抗血小板治疗的时间，同时降低晚期支架内血栓的发生率。
　　 研究目的:
　　 (1)建立AS动物模型;
　　 (2)通过血管内超声观察实验动物腹主动脉粥样硬化板块形态并于特定位置行支架植入术;
　　 (3)测定模型动物干预前后血生化各项指标;
　　 (4)联合应用血管内超声(IVUS)、病理学及免疫组织化学技术，探明口服雷帕霉素抑制支架内再狭窄的作用及其分子机制;
　　 (5)观察金属裸支架植入联合口服雷帕霉素能否起到与雷帕霉素洗脱支架植入起到类似的效果，进而为为冠心病的临床防治提供理论和实验依据。
　　 材料与方法:
　　 24只雄性纯种新西兰大白兔，在适应性喂养1周后，每只兔均由耳缘静脉抽取4ml血标本，检测TC、LDLL、HDLL等血脂变化。对全部实验兔行球囊损伤腹主动脉，3％戊巴比妥钠30mg/kg麻醉动物后，穿刺右股动脉，将内径3.0mm、长15mm的球囊导管送入降主动脉约20cm，14个大气压充盈球囊后反复回拉3次以造成腹主动脉内膜损伤，结扎股动脉远段，缝合伤口。肌肉注射给予抗生素预防感染。给予高脂饲料(1％胆固醇，每只120-140g/d_)喂养8周。喂养8周末，每只实验兔抽取4ml静脉血测血脂指标，并将实验动物随机分为3组，每组8只。分别为裸支架植入组(BMS组)、裸支架+口服雷帕霉素组(BMS+RAPA组)、雷帕霉素药物支架组(DES组)。所有动物均予以3％戊巴比妥钠麻醉，暴露右侧股动脉，行腹主动脉造影，观察腹主动脉斑块情况，并行IVUS检查，具体操作如下:分离右股动脉，在0.014英寸导引钢丝及扩张管辅助下，立即按100u/kg给予肝素静注抗凝，沿导引钢丝在造影影像指引下，插入血管内超声探头导管，通过狭窄病变至血管远端，然后缓慢回撤探头导管，测量预备置放支架部位的各项指标:管腔最小直径(MLD)，血管外弹力膜面积(EEMA)、管腔面积(LA)、斑块面积(PA)、斑块负荷(PB)病变部位及参考部位的血管外弹力膜面积(EEMA)、管腔面积(LA)、斑块面积(PA)、斑块最厚处直径(Dmax)及其对侧斑块最薄处直径(Drain)。按照公式计算斑块的偏心指数(EI)及血管的重构指数(RI):EI=Dmax/Drain，RI=病变处EEMA/参考部位近端与远端EEMA平均值。所有支架组实验动物，选择合适部位(位置选在肾动脉下1mm)置放支架，以16-20ATM释放支架，支架型号均为3.0*12mm，之后再行IVUS检查，留存影像，结扎右侧股动脉远段，缝合伤口。肌肉注射给予抗生素预防感染2天。肌肉注射肝素2500u/d周。术后所有实验兔继续给予高脂喂养4周。其中BMS+RAPA组家兔，给予雷帕霉素口服4周，剂量为0.5mg/kg/d。4周末，每只实验动物抽取4ml静脉血测血脂指标后，行IVUS检测各指标并计算支架组管腔丢失后，全部处死，留取支架部及之间近远端血管组织。每只兔的血管组织标本取1mm段血管行电镜检查找巨噬细胞后分为两半，一半甲醛浸泡行HE染色等病理学研究，一半冻于-80度冰箱行分子生物学实验。统计分析采用SPSS13.0统计软件，计量资料用X±s表示，计数资料用百分数表示，多组间比较采用ANOVA方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。
　　 结果
　　 (1)IVUS结果显示BMS+RAPA组及DES组的PA、PB均明显小于BMS组(P均＜0.01），而MLD明显高于BMS组，支架植入4周后管腔丢失明显小于BMS组（P均＜0.05）;
　　 (2)造模后兔的各项血脂指标明显升高（P＜0.05)（表1），而干预4周后三组间的差异均无统计学意义。（表2）
　　 (3)病理学检测显示BMS组支架植入后内膜增生明显，管腔面积狭窄率明显大于BMS+RAPA组及DES组(P＜0.05)，BMS+RAPA组血管内皮化良好，而DES组内皮化修复延迟明显，支架直接暴露于管腔。
　　 (4)干预4周后BMS+RAPA组及DES组的斑块局部mTOR表达明显低于BMS组(P＜0.05)。
　　 （5)电镜检测:干预四周后BMS组斑块其间可见泡沫细胞聚集，BMS+RAPA组及DES组斑块内泡沫细胞明显少于BMS组。
　　 结论
　　 (1)口服雷帕霉素能够抑制支架植入处的内膜增生、防止支架内再狭窄，口服雷帕霉素配合裸支架治疗具有减少管腔面积丢失、降低斑块负荷方面的作用，与雷帕霉素涂层支架作用相似，与裸支架组相比，可以更有效地减小斑块面积、减少管腔面积丢失，降低再狭窄的发生率。
　　 (2)口服雷帕霉素配合裸支架与雷帕霉素药物支架抑制支架内再狭窄的作用相似。
　　 (3)雷帕霉素主要是抑制了斑块局部的mTOR，减少局部斑块的炎症反应和脂质沉积，减少支架内平滑肌细胞的增殖，进而抑制了支架内再狭窄。
　　 (4)口服雷帕霉素可以有效地减缓斑块进展，而且在裸支架置入的同时配合口服雷帕霉素，在预防再狭窄、减少出血等并发症方面具有明显的优势，具有较好的临床应用前景。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

1．材料和方法

结果

讨论

结论

附表

附图

参考文献

攻读硕士学位期间发表论文情况

致谢

学位论文评阅及答辩情况表