口服雷帕霉素抑制支架内再狭窄作用的实验研究

摘要

背景：当今，冠状动脉病变患者接受经皮冠状动脉介入治疗已日益普遍，药物洗脱支架(DES)明显减少再狭窄发生率，得到了许多临床试验的证明。其中雷帕霉素洗脱支架可有效降低支架内及支架所在节段的再狭窄发生率。研究发现利用药物雷帕霉素抑制mTOR，通过促进肿瘤细胞的自体吞噬而抑制肿瘤的发生发展。由于mTOR在PI3K/AKT/mTOR/p70sK信号通路中处于核心地位，选择性mTOR抑制剂雷帕霉素在AS中的作用再一次引起人们的关注。雷帕霉素具有良好的抑制血管新生内膜过度增殖的效应，将雷帕霉素涂布在冠状动脉支架表面，植入支架后局部药物释放，可预防支架内再狭窄，这一作用也已在大量的临床试验中得以证实。研究发现雷帕霉素具有独特的药理作用机制，能抑制有丝分裂诱导的P27kip1表达。P27kip1是细胞周期蛋白(cyclin)依赖激酶的抑制剂，Diez-Juan等研究发现，去除P27kip1类的细胞周期(cyclin)依赖激酶抑制剂，能够促进AS的发展。研究表明雷帕霉素能抑制单核细胞/巨噬细胞相关的细胞因子的产生，尤其是MCP-1与IL-6。Suzuki等研究表明雷帕霉素能显著减低主动MCP-1mRNA水平。Basso等研究表明，应用雷帕霉素12周后尽管血中CH含量无变化，但主动脉弓病变处CH含量与对照组比较减少36％，分析雷帕霉素减少AS病变，独立于影响胆固醇的代谢作用。最近研究发现，雷帕霉素的抗增殖以及减少炎症反应与选择性抑制PI3K/Akt/mTOR信号传导通路有关。Chen等研究发现口服雷帕霉素能够明显降低动脉粥样硬化家兔的斑块的负荷，可通过抑制mTOR，来减少斑块中巨噬细胞的浸润，减少斑块的炎症反应，亦增加纤维帽中平滑肌数量，进而稳定斑块，这种作用不降低血脂水平。近些年来，血管内超声成像技术(IVUS)在冠脉介入手术中的价值己日益显著，由于其能够准确的显示斑块及血管壁情况，能够观测到支架贴壁与否以及支架后再狭窄情况，已成为冠心病诊断的“金标准”。在认识到口服雷帕霉素对斑块的积极作用后，我们希望借助血管内超声的影像学手段，评估口服雷帕霉素配合金属裸支架治疗减少再狭窄的效果，以期此法成为一种更好的冠状动脉介入治疗方案。我们推测：此方案可降低金属裸支架置入后的血管再狭窄率，达到与置入药物涂层支架的相似的效果，应用金属裸支架还可以降低支架内血栓发生率，并减少抗凝药物的给药时间，降低颅内出血、消化道大出血风险。目前，国内外对此方面的报道很少。
　　 目的：⑴对比口服雷帕霉素+金属裸支架与雷帕霉素涂层支架在降低再狭窄方面的效果。⑵探讨口服雷帕霉素+金属裸支架是否能够成为冠状动脉介入治疗的更佳方案。
　　 方法：40只雄性纯种新西兰大白兔，在适应性喂养1周后，每只兔均由耳缘静脉抽取4ml血标本，检测TC、LDL-L、HDL-L等血脂变化。对全部实验兔行球囊损伤腹主动脉，3％戊巴比妥钠30mg/kg麻醉动物后，穿刺右股动脉，将内径3.5mm、长15mm的球囊导管送入降主动脉约20cm，14个大气压充盈球囊后反复回拉3次以造成腹主动脉内膜损伤，结扎股动脉远段，缝合伤口。肌肉注射给予抗生素预防感染。给予高脂饲料(1％胆固醇，120-140g.d-1.只-1)喂养8周。喂养8周末，每只实验兔抽取4ml静脉血测血脂指标，并将实验动物随机分为五组，每组8只。分别为对照组、口服雷帕霉素组（RAPA组）、裸支架组(BMS)、裸支架+口服雷帕霉素组（BMS+RAPA组）、雷帕霉素药物支架组(DES组)。所有动物均予以3％戊巴比妥钠麻醉，暴露右侧股动脉，行腹主动脉造影，观察腹主动脉斑块情况，并行IVUS检查，具体操作如下：分离右股动脉，在0.014英寸导引钢丝及扩张管辅助下，立即按100u/kg给予肝素静注抗凝，沿导引钢丝在造影影像指引下，插入血管内超声探头导管，通过狭窄病变至血管远端，然后缓慢回撤探头导管，测量预备置放支架部位的各项指标：管腔最小直径(MLD)，血管外弹力膜面积(EEMA)、管腔面积(LA)、斑块面积(PA)、斑块负荷(PB)病变部位及参考部位的血管外弹力膜面积(EEMA)、管腔面积(LA)、斑块面积(PA)、斑块最厚处直径(Dmax)及其对侧斑块最薄处直径(Dmin)。按照公式计算斑块的偏心指数(EI)及血管的重构指数(RI):EI=Dmax/Dmin，RI=病变处EEMA/参考部位近端与远端EEMA平均值。所有支架组实验动物，选择合适部位(位置选在肾动脉下1mm)置放支架，以16-20ATM释放支架，支架型号均为3.0*12mm，之后再行IVUS检查，留存影像，结扎右侧股动脉远段，缝合伤口。肌肉注射给予抗生素预防感染2天。肌肉注射肝素2500u/d一周。术后所有实验兔继续给予高脂喂养4周。其中RAPA组以及BMS+RAPA组家兔，给予雷帕霉素口服4周，剂量为0.5mg/kg/d。4周末，每只实验动物抽取4ml静脉血测血脂指标后，行IVUS检测各指标并计算支架组管腔丢失后，全部处死，留取支架部及之间近远端血管组织。每只兔的血管组织标本取1mm段血管行电镜检查找巨噬细胞后分为两半，一半甲醛浸泡行HE染色等病理学研究，一半冻于-80度冰箱行分子生物学实验。统计分析采用SPSS13.0统计软件，计量资料用x±s表示，计数资料用百分数表示，多组间比较采用ANOVA方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。
　　 结果：①与对照组及裸支架组比较，口服雷帕霉素组、裸支架+口服雷帕霉素组以及雷帕霉素涂层支架组的血脂指标未见明显降低(P＞0.05)。②口服雷帕霉素组、裸支架+雷帕霉素组、雷帕霉素药物支架组的PA、PB均明显小于对照组和裸支架组（P＜0.01）。③裸支架+雷帕霉素组、雷帕霉素药物支架组的MLD明显高于裸支架组（P＜0.05）。④裸支架+雷帕霉素组、雷帕霉素药物支架组的管腔丢失明显小于裸支架组（P＜0.05）。⑤而裸支架+雷帕霉素组、雷帕霉素药物支架组间各IVUS指标未见明显差异(P＞0.05)。⑥口服雷帕霉素组兔的血管外弹力膜面积(EEMA)、管腔面积(LA)丢失都少于对照组。⑦电镜检测:对照组斑块其间可见巨噬细胞聚集,口雷帕霉素的各组及雷帕霉素支架组斑块巨噬细胞明显减少。
　　 结论：在本研究中，我们成功得到了支架置入术后的动物模型。利用IVUS对此模型进行动态研究血管斑块段的IVUS的影像学特征，发现口服雷帕霉素组兔的血管外弹力膜、管腔面积丢失都少于对照组。我们还发现雷帕霉素配合裸支架治疗，对减少管腔面积丢失、降低斑块负荷方面具有与雷帕霉素涂层支架相似作用，而与裸支架组相比对于减小斑块面积、减少管腔面积丢失，降低再狭窄的发生率确实更加有效。所以我们得出的结论是：口服雷帕霉素可以有效地减缓斑块进展；口服雷帕霉素辅助裸支架治疗，与直接置入雷帕霉素支架的预防再狭窄作用相似。