β-葡萄糖苷酶高产菌株Peni-1的产酶优化、菌种改造及应用研究

摘要

β-葡萄糖苷酶(E.C3.2.1.21.)能够水解糖苷键,从糖苷或寡糖上释放非还原的末端葡萄糖残基。这些酶在古细菌、真细菌和真核生物中广泛存在,并发挥着许多重要的生物学功能,包括微生物的生物质转化,在动物中糖脂和外源糖苷的分解,细胞壁寡糖的分解代谢和木质化,生物防御,植物激素的激活,植物香气的释放等。近年来β-葡萄糖苷酶的研究和开发成为生物技术领域的热点,它们己在造纸、印染、纺织、医药、食品、饲料、石油开采及生物技术研究等多方面得到了广泛的应用,发展前景广阔。因此本研究的主要目的是通过对本实验室筛选到的一株斜卧青霉Peni-1的发酵条件优化和育种改造,旨在解决目前β-葡萄糖苷酶产量较低、成本高等问题,提供更好的高产β-葡萄糖苷酶的优良的工业菌株。
　　本论文的主要研究结果如下:
　　(1)以斜卧青霉Peni-1为β-葡萄糖苷酶生产菌种,在摇瓶和7.5 L发酵罐水平上对其液态发酵条件进行了优化。
　　在摇瓶试验中,通过单因素实验,分析了装液量、碳源、氮源、麸皮用量、pH、补料和表面活性剂对产酶的影响,得到了产酶的最佳培养基条件是:麦麸3%,麦草粉3%,微晶纤维素0.6%,(NH4)2SO40.4%,KH2PO40.1%,MgSO40.05%,CaCl20.05%,微量离子液1.0 ml/L培养基,吐温-800.2%,初始pH3.5。最佳产酶发酵条件:装液量40 mL/300 mL摇瓶,摇床转速200 rpm,培养温度30℃,在第3 d补加0.5 g麸皮和0.2%(NH4)2SO4,培养时间5 d。
　　在7.5 L发酵罐水平上,分析了种子培养条件、转速、通气量、DO、pH、中期补氮、高底物浓度、变温和瞬时刷料对产酶的影响,得到产酶的最佳条件是:在基本初始培养基基础上,调整麸皮和麦草粉用量各为4%;培养温度0-48 h30℃,48 h至发酵结束28℃;初始通气量1.5 SLPM,初始搅拌转速300 rpm,调整通气量和搅拌转速保证DO不低于30%;发酵中后期控制pH不低于3,不高于3.5;48 h补加0.2%(NH4)2SO4;间隔一定时间,瞬时提高转速冲刷粘料。
　　(2)以斜卧青霉Peni-1为出发菌株,应用DES-UV复合诱变和等离子体诱变技术对其进行了诱变育种
　　通过DES-UV复合诱变和等离子体诱变技术对斜卧青霉Peni-1进行处理,得到了2株β-葡萄糖苷酶高产菌株D10042804和D10050110,其β-葡萄糖苷酶酶活分别比出发菌株提高了33.5%和26.5%。
　　(3)应用cbhl强启动子构建了bgl基因过表达盒,在斜卧青霉Peril-1中进行了β-葡萄糖苷酶的过表达。
　　克隆了斜卧青霉114-2cel7A-2的启动子(cbhl强启动子)和斜卧青霉Peni-1的bgl基因,以硫胺素基因为抗性标记,通过融合PCR连接基因片段构建bgl过表达盒,并将其通过PEG-CaCl2法转化斜卧青霉Peril-1原生质体,得到了转化株。
　　(4)利用β-葡萄糖苷酶转化虎杖中的白藜芦醇苷生产白藜芦醇进行了工艺条件优化
　　首先,利用β-葡萄糖苷酶粗酶液转化虎杖中的白藜芦醇苷生产白藜芦醇进行了工艺条件优化,得到了最佳酶解和提取条件为:酶解固液比为1:15,酶用量为5 IU/g虎杖粉,体系初始pH为4.8,旋转培养器50 rpm,50℃酶解2.5 h。酶解后提取乙醇终浓度为50%,提取固液比1:30,提取两次,每次2 h。东北虎杖的白藜芦醇最大得率为16 mg/g。然后,制备了β-葡萄糖苷酶固定化酶,在优化后的条件下酶法转化提取了虎杖中的白藜芦醇。两种方法均得到了较高的产量。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:符号说明及缩略词

第一章 绪论

1.1 葡萄糖苷酶的酶学特性及催化机制

1.1.1 β-葡萄糖苷酶的酶学特性

1.1.2 β-葡萄糖苷酶的催化机制

1.2 β-葡萄糖苷酶的来源

1.3 β-葡萄糖苷酶生产工艺

1.3.1 液态发酵

1.3.2 其它发酵工艺

1.3.3 发酵法生产β-葡萄糖苷酶的影响因素

1.4 β-葡萄糖苷酶的固定化方法

1.5 菌种改造

1.5.1 诱变育种

1.5.2 构建基因工程菌

1.6 提高目的蛋白表达量的策略

1.7 β-葡萄糖苷酶的应用

1.7.1 在食品工业中的应用

1.7.2 在纤维素降解中的应用

1.7.3 其它应用

1.7.4 β-葡萄糖苷酶在转化虎杖中白藜芦醇苷生成白藜芦醇的应用

1.7.5 白藜芦醇的提取方法

1.8 本论文的研究目的、主要内容及意义

第二章 斜卧青霉Peni-1摇瓶液态培养产酶条件优化

引言

2.1 材料和方法

2.1.1 菌株、培养基及培养条件

2.1.2 常用试剂与设备

2.1.3 菌株的复壮

2.1.4 酶活力测定与蛋白质分析

2.1.5 产酶条件优化

2.2 结果与分析

2.2.1 菌株的复壮

2.2.2 产酶曲线

2.2.3 产酶条件的优化

2.2.4 工艺验证

2.3 小结

第三章 搅拌式发酵罐生产工艺研究

引言

3.1 材料和方法

3.1.1 菌株、培养基及培养条件

3.1.2 常用试剂与设备

3.1.3 相关参数的测定

3.1.4 种子培养条件

3.1.5 7.5 L发酵罐发酵工艺研究

3.2 结果与讨论

3.2.1 种子培养条件的影响

3.2.2 7.5 L发酵罐液体深层发酵工艺的优化

3.3 小结

第四章 斜卧青霉菌株的诱变、筛选及突变株产酶的研究

引言

4.1 材料和方法

4.1.1 菌株、培养基及培养条件

4.1.2 常用缓冲液、主要试剂及仪器

4.1.3 酶活力测定

4.1.4 DES诱变

4.1.5 DES-UV复合诱变

4.1.6 等离子体复合诱变

4.1.7 平板初筛

4.1.8 摇瓶复筛

4.1.9 高产菌株的传代稳定性实验

4.2 结果与讨论

4.2.1 筛选平板的优化

4.2.2 诱变剂量与致死率

4.2.3 菌株诱变结果

4.2.4 诱变株的遗传稳定性

4.3 小结

第五章 利用基因工程技术在Peni-1中进行β-葡萄糖苷酶过表达

引言

5.1 材料和方法

5.1.1 菌株和质粒

5.1.2 培养基

5.1.3 常用缓冲液、试剂与仪器

5.1.4 过表达盒的构建

5.1.5 融合片段的酶切验证

5.1.6 原生质体的制备和转化

5.1.7 斜卧青霉转化子染色体基因组的小量提取

5.1.8 转化子筛选

5.1.9 蛋白浓度及酶活测定

5.2 结果与讨论

5.2.1 基因组DNA的质量

5.2.2 目的基因的克隆

5.2.3 过表达盒的构建

5.2.4 过表达盒的酶切验证

5.2.5 转化子的筛选

5.2.6 转化子的酶活测定

5.3 小结

第六章 虎杖苷的转化和白藜芦醇的生产

引言

6.1 材料与方法

6.1.1 材料与仪器

6.1.2 实验方法

6.2 结果与讨论

6.2.1 测定方法的建立

6.2.2 虎杖样品中白藜芦醇和虎杖苷的含量测定

6.2.3 虎杖苷标品(PD)的酶解

6.2.4 虎杖酶法提取效果的确证

6.2.5 产物提取策略的确定

6.2.6 酶解条件的优化

6.2.7 提取条件的优化

6.2.8 工艺验证

6.2.9 固定化酶的制备和对虎杖的酶法提取

6.3 小结

全文总结与展望

1 本论文取得的创新性成果

2 本论文存在的问题及深入方向

参考文献

致谢

学位论文评阅及答辩情况表