量子点结合荧光共振能量转移技术检测微球菌核酸酶和汞离子

摘要

微球菌核酸酶(MNase)是由金黄色葡萄球菌分泌的一种胞外核酸内切酶，可以较好地分解DNA中富含AT区域或RNA中富含AU区域，产物为3'-磷酸的单核苷酸或寡核苷酸。MNase在核酸水解、RNA测序、染色质和蛋白质的结构研究等方面都具有重要意义。此外，还可以通过检测MNase来衡量金黄色葡萄球菌的存在及其致病性。
　　 汞是一种危害极大的重金属污染物，存在于水、空气和土壤等环境介质中。二价汞离子（Hg2+）是汞污染物中最常见，最稳定的形式。通过甲基化作用，Hg2+能够转变为有机汞，并经食物链富集，最终进入动物和人体内，严重危害动物和人类的健康。因此，发展灵敏的Hg2+检测方法对于环境、食品工业方面具有重要的意义。
　　 荧光共振能量转移(FRET)技术作为一种高效的光学“分子尺”，在核酸检测、免疫分析、酶活性分析等方面都有着广泛的应用。但是由于许多有机染料易光漂白，吸收光谱窄，发射光谱较宽且伴有拖尾，斯托克斯位移小，使得FRET的应用受到了限制。量子点(QDs)作为一种新型的荧光纳米材料，相对于有机染料有很多优点，可以较好地应用于FRET。
　　 鉴于MNase和Hg2+检测的重要性，本文利用FRET技术结合QDs独特的光学性质，建立了适用于MNase和Hg2+的检测新方法。
　　 本文共分为三个部分:
　　 本文第一章为绪论部分，该部分概述了FRET的原理，荧光探针的研究进展以及QDs的光学性质、合成修饰方法，并重点介绍了QDs-FRET体系在核酸检测、免疫分析、酶活性分析等方面的应用。
　　 本文第二章构建了多肽桥联的QDs-FRET体系，并成功应用于MNase的检测。该方法中，基于静电的相互作用，正电荷的多肽作为媒介，将负电荷的QDs和负电荷的ROX-ssDNA连接组成FRET体系。MNase对ssDNA的消化作用使得能量转移效率发生改变，从而可达到检测MNase的目的。方法的线性范围为4.0×10-3～8.0×10-2UmL-1，检出限为2.9×10-3UmL-1。该方法简单灵敏，无需对QDs进行任何共价修饰，不需要双标记的DNA。
　　 本文第三章建立了一种基于量子点和切刻内切酶辅助信号放大方法检测Hg2+的研究方法。首先，量子点与标有淬灭剂的发卡结构探针A结合，此时，量子点与淬灭剂距离靠近发生FRET，量子点的荧光被淬灭。当Hg2+存在时，由于T-Hg2+-T的形成，探针B与探针A环部杂交，发夹结构打开，导致淬灭剂与量子点的距离变远，量子点的荧光恢复。随后，在Nt.A(l)WI对探针A的切割作用下，Hg2+和探针B被释放出来后重新参与杂交，完成多次循环，使量子点的荧光不断恢复，实现检测信号的放大。在最佳的实验条件下，QDs的荧光强度在Hg2+浓度为1.0×10-9molL-1～1.5×10-8molL-1的范围内呈现良好的线性关系，检出限为8.0×10-10molL-1。此外，研究结果表明该方法具有良好的选择性。