半乳糖凝集素-3在舌癌侵袭和转移中的作用及机制研究

摘要

目的：舌癌是口腔颌面部最常见的恶性肿瘤之一，在我国约占全部口腔癌的40％。舌癌复发、转移率高，临床预后较差。尽管近几十年来其治疗方法不断得以改进和完善，但患者的五年生存率并未得到显著提高。肿瘤的局部复发和区域性淋巴转移是舌癌患者治疗失败的主要原因，而肿瘤细胞的迁移和侵袭是肿瘤转移和复发过程中的重要因素，因此有关肿瘤细胞迁移和侵袭机制的研究成为该领域的热点之一。半乳糖凝集素-3(galectin-3，Gal-3)为半乳糖结合蛋白家族成员，具有多种生物学功能，在许多肿瘤细胞的迁移和侵袭过程中起重要作用。研究发现Gal-3舌癌组织中过表达，但其在舌癌侵袭转移中的作用和确切机制尚不十分清楚。近年研究发现，Gal-3在某些肿瘤组织中的表达与β-catenin有关。由于β-catenin是经典Wnt信号传导通路中的关键调控因子，因此我们猜测Gal-3可能通过Wnt/β-catenin信号传导通路调控舌癌细胞的迁移和侵袭。本课题采用免疫组织化学染色对76例舌癌组织标本中Gal-3的表达进行分析，结合临床资料研究Gal-3表达与舌癌相关临床病理因素的关系；应用RNA干扰技术沉默人舌癌细胞系SCC-4和CAL27中Gal-3基因，研究其在舌癌细胞增殖、迁移和侵袭中的作用；通过检测Gal-3基因沉默前后Wnt/β-catenin信号传导通路中关键因子表达水平的改变，探讨Gal-3在舌癌细胞中表达与Wnt/β-catenin信号传导通路的关系，旨在为进一步阐明舌癌的侵袭和转移机制提供新的理论依据。
　　 方法：1.采用免疫组织化学SP法，对2005～2010年于山东大学齐鲁医院口腔颌面外科就诊的76例舌癌患者肿瘤组织标本中Gal-3的表达进行检测，并结合临床资料分析Gal-3表达与肿瘤分化、临床分期、区域淋巴结转移等临床病理因素间的关系。
　　 2.将液氮保存的舌癌细胞SCC-4和CAL27于37℃水浴中快速溶化，用预冷的培养基混匀已融化的肿瘤细胞悬液，在4℃下1800 rpm离心10 min。弃上清，重悬细胞于新鲜培养液中，SCC-4采用：RPMI1640，CAL27采用高糖DMEM培养基进行常规培养。收集对数生长期细胞用于实验。
　　 3.采用阳离子脂质体法进行转染。将细胞分为空白对照组、阴性对照组和实验组，按照Invitrogen公司LiporectamineTM RNAiMAX试剂说明书操作，分别将control-siRNA和Gal-3-siRNA瞬时转入阴性对照组和实验组细胞，空白对照组细胞不做任何处理。37℃，5％CO2条件下培养6 h后，替换为含血清的生长培养基。转染后48 h，对细胞生物学行为以及相关因子的表达进行检测。
　　 4.转染后48 h收集各组细胞，采用Trizol法提取总RNA。采用TIANGEN公司Quantscript RT Kit试剂盒，取模板RNA1μg，加入反转录反应体系，合成cDNA第一链。应用TIANGEN公司ReaMasterMix(SYBR Green)试剂盒，以1μl cDNA为模板，在7500 Real Time PCR System中进行扩增，应用SequenceDetection Software version1.4对Gal-3的表达进行分析。以β-肌动蛋白(β-actin)作为内参照。引物序列为：Gal-3上游引物5’-GGCCACTGA-TTGTGCCTTAT-3’，下游引物5’-TGCAACCTTGAAGTGGTCAG-3’；β-actin上游引物5’-CTCCTC-CTGAGCGCAAGTACTC-3’，下游引物5’-TCCTGCTTGCTGATCCACATC-3’。
　　 5.转染后48 h收集细胞，用RIPA细胞裂解液提取细胞总蛋白。采用BCA法进行蛋白定量。取50μg蛋白上样，12％SDS-PAGE胶垂直电泳后电转移至PVDF膜，用5％脱脂奶粉封闭过夜，加入1:1000兔抗人Gal-3多克隆抗体，4℃反应过夜，TBST洗膜，加入1:2000辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，室温孵育2 h，ALP显色。扫描、分析Gal-3蛋白的表达。以β-actin作为内参照。
　　 6.采用MTT法检测细胞的增殖能力。细胞接种于96孔板，每孔细胞数约为2.0×103。37℃，5％CO2条件下过夜，细胞达到铺满30～50％时进行转染。分别于转染后0 h、24 h、48 h和72 h在每孔加入CCK-810μl，继续常规培养4h。用酶标仪测定在450 nm处的吸光度(OD值)，记录结果。以时间为横轴，OD值为纵轴绘制细胞生长曲线。
　　 7.将适当密度转染后的细胞接种于24孔培养板，形成细胞单层。用移液器滴头沿培养板底部形成“一”字划痕。镜下记录划痕相对距离，更换体积分数为1％胎牛血清的RPMI1640/H-DMEM培养基，24 h后更换体积分数为10％胎牛血清的RPMI1640/H-DMEM培养基，继续培养24 h，镜下观察各组肿瘤细胞迁移能力的差异。
　　 8.应用Transwell小室法观察Gal-3基因沉默对SCC-4和CAL27细胞侵袭能力的影响。RNA干扰后48 h，收集各组细胞，制备单细胞悬液，调整细胞密度为2×106/ml。将细胞悬液加入Transwell小室中，每孔100μl，将小室浸于24孔板的条件培养基中，37℃，5％CO2孵箱内孵育8 h。取出Transwell小室，滤膜用甲醇固定1分钟。HE染色，显微镜下观察、照相并计数。
　　 9.转染后48 h，收集各组细胞，采用WB法对对肿瘤细胞中β-catenin蛋白的表达水平进行检测；采用RealTime RT-PCR法对其mRNA的表达进行检测。β-catenin引物序列为：上游引物5’-GCCGGCTATTGTAGAAGCTG-3’，下游引物5’-GAG-TCCCAAGGAGACCTTCC-3’。采用免疫荧光法染色，并应用共聚焦显微镜观察转染前后β-catenin在SCC-4亚细胞结构中定位的变化情况。
　　 10.转染后48 h，采用相同方法检测各组细胞中Akt、pAkt、GSK-3β和pGSK-3β蛋白的表达。并于转染后0 h、12 h、24 h和48 h，检测实验组SCC-4细胞中Gal-3、β-catenin、pAkt和pGSK-3β蛋白的表达。
　　 11.为进一步明确Akt磷酸化在Gal-3/β-catenin轴中的作用，分别采用Akt抑制剂和(或)Gal-3-siRNA对SCC-4进行处理。Gal-3-siRNA转染后48 h，采用WB法检测各组细胞中Akt、pAkt和β-catenin蛋白的表达。
　　 12.为证实Gal-3沉默系通过抑制Wnt/β-catenin信号通路下游靶基因的表达影响舌癌细胞的迁移和侵袭，于转染后48 h，分别采用RT-PCR法和WB法检测SCC-4中MMP-9 mRNA及蛋白的表达。
　　 结果：1.76例患者肿瘤组织标本中Gal-3表达的阳性率为86.8％。着色主要位于肿瘤上皮细胞和肿瘤间质中纤维细胞的胞浆，胞核染色为阴性。Gal-3表达的强度与颈淋巴结转移和肿瘤临床分期有关，与患者年龄、性别、肿瘤大小及组织分化程度等因素无显著相关性。
　　 2.实验发现，在转染后48 h，Gal-3-siRNA处理组Gal-3 mRNA及蛋白的表达明显受到抑制。Gal-3-siRNA转染对SCC-4和CAL27细胞Gal-3 mRNA表达的抑制率分别为99.4％和98.6％。实验组细胞中Gal-3蛋白的表达亦显著降低。在肿瘤细胞生物学行为方面，实验显示，在转染后72 h内，Gal-3-siRNA处理组肿瘤细胞在增殖能力方面较阴性对照组和空白对照组无显著下降。而细胞划痕实验显示，Gal-3沉默可显著降低两种细胞的迁移能力。Gal-3-siRNA处理组细胞的划痕愈合时间较阴性对照组组和空白对照组明显延长。此外，实验通过Transwell小室法证实，抑制Gal-3基因的表达可显著降低舌癌细胞的侵袭能力。
　　 3.本研究对Gal-3-siRNA作用后舌癌细胞中β-catenin的表达进行检测发现，Gal-3沉默可显著影响肿瘤细胞中β-catenin蛋白的水平。为明确Gal-3对β-catenin表达的调控是否发生在转录阶段，我们对β-catenin mRNA的水平进行了检测。实验发现虽然Gal-3沉默导致β-catenin蛋白下调，但其mRNA的表达水平并未发生显著改变。提示Gal-3沉默对β-catenin表达的影响发生在转录后阶段。通过免疫荧光法染色，观察转染前后β-catenin在SCC-4亚细胞结构中定位发现，在SCC-4中Gal-3-siRNA转染后48 h，β-catenin在胞浆与胞核中的表达均显著降低。
　　 4.为明确Gal-3在β-catenin表达调控中的作用机制，我们对Wnt信号传导通路中的关键调控因子Akt和GSK-3β的总蛋白和磷酸化蛋白的水平进行了检测。研究发现，在各组细胞中Gal-3沉默并未导致Akt和GSK-3β总蛋白水平发生明显变化，然而在实验组细胞中两种蛋白的磷酸化形式显著降低。相反，对照组中pAkt和pGSK-3β的水平无明显变化。本研究还对实验组SCC-4细胞中Gal-3、pAkt、pGSK-3β以及β-catenin蛋白水平的时相变化进行了分析。实验结果显示，Gal-3、pAkt、pGSK-3β-及β-catenin的水平均较转染前显著降低。同时，研究发现pAkt和pGSK-3β水平的降低发生于转染后12小时，早于β-catenin蛋白下调发生的时间。此外，本研究发现应用Akt抑制剂抑制Akt磷酸化与应用Gal-3-siRNA沉默Gal-3基因的表达均可导致SCC-4中β-catenin蛋白表达显著下降。应用Akt抑制剂后，再加入Gal-3-siRNA不会引起β-catenin蛋白水平进一步降低。
　　 5.应用RT-PCR法和WB法检测发现，转染后48 h舌癌细胞SCC-4中MMP-9mRNA和蛋白表达水平均显著降低。
　　 结论：1.Gal-3过表达与舌癌的侵袭和转移相关。
　　 2.沉默Gal-3可显著抑制舌癌细胞SCC-4与CAL27的迁移和侵袭能力。
　　 3.抑制Gal-3基因表达，可导致舌癌细胞中β-catenin蛋白水平下调，但不影响其转录；Gal-3基因沉默使β-catenin蛋白在胞浆与胞核中的水平均显著降低。
　　 4.Gal-3表达可能通过活化Akt，调控GSK-3β磷酸化水平及胞浆β-catenin的快速降解过程，从而作用于Wnt信号通路下游靶基因，最终影响舌癌细胞的迁移和侵袭。