用于在哺乳动物中增加母体子宫的胚胎植入率的方法,有效量的β-半乳糖苷-结合凝集素或其衍生物、β-半乳糖苷-结合凝集素或衍生物和产品的用途

摘要

本发明涉及用于在哺乳动物中增加母体子宫的胚胎植入率的方法：通过将有效量的β-半乳糖苷-结合凝集素或其衍生物、以及包含所述凝集素的产品给予哺乳动物子宫。

说明书

发明领域

本发明涉及在哺乳动物中增加母体子宫的胚胎植入率的方法，即通过给予所述哺乳动物子宫有效量的β-半乳糖苷-结合凝集素或其衍生物、以及包含所述凝集素的产品。

相关技术的描述

农业产业在巴西经济中起到关键作用，因为它在国民生产总值中占有相当大的份额并对贸易平衡作出积极贡献。

为了确保其在农业市场上的利润率，农业所有物(agricultural property)应当维持最高的牲畜生殖效力，以满足消费者对高质量产品的需要。在这个意义上说，维持足够的出生率是导致有利可图的农业所有物的事件链上的关键性因素。然而，在大多数情况下，维持最佳生殖水平是一项困难的任务，因为早期妊娠胚胎的丧失率高。

生殖可被定义为在一系列生理事件之后从某一物种中孕育出同种活体，这继而取决于多个因素。在农业领域使用现有技术水平的生殖技术在牲畜的遗传改进中可具有关键性作用，增加妊娠潜力(将胚胎植入母体子宫内)，以确保动物工作寿命期间的最大生产率。

然而，在全世界范围内，对养殖者的经济损失而言，胚胎丧失是最常见原因之一；因此，考虑到妊娠诊断和妊娠维持中所涉及到的复杂机制，预防早期胚胎丧失仍然是一个挑战。

鉴别哺乳动物母体子宫中的胚胎植入率的早期诊断是农业程序(agricultural procedure)的关键性工具，因为它允许养殖者采取预防性措施并使最终的经济损失减至最小。因此，根据牛(cattle)卵巢的生殖生理学的改进的知识，已经开发出新的技术，以达到更好的生殖结果并降低处理成本。

与牛的体外受精类似，辅助生殖技术变得越来越普及，因为有市场需求。牛的有效生殖性能直接涉及到来自奶牛品种的大量小母牛和来自肉牛品种的小公牛的出生，因而为农业所有物获得经济利益。

其它的市场特征，例如全球消费者对质量的要求，动物来源产品的规模和标准化，以及对繁育、农业和生物能源领域的空间争夺，都刺激了对更高生产率的探索，使生殖生物技术得以快速改善。

与全球初级市场的生产和消费需求相符合，巴西的农业生产依赖于辅助生殖技术，以增加牛群的平均生产率，因为所述技术显著增加了遗传上优良动物的出生。

用于农业所有物的主要生殖技术包括: (i) 经自然方式交配或生殖；(ii) 人工授精；(iii) 体内产生，然后胚胎移植；和(iv) 体外产生，然后胚胎移植。无论所选技术如何，生殖方法的主要目标是允许繁殖物种的最大性能，得到积极结果。

交配是一项广泛使用的技术，因为对于养殖者而言是较不昂贵的，但它对性传播疾病而言具有有限的控制并且对兽群提供较缓慢的遗传改良。在该程序中，胚胎包含50%来自父本的遗传物质(因此，不同于来自母本的遗传物质)，这可引起形成大量的同种异体抗原(alloantigen)并导致胚胎丧失，因为缺乏母-胎耐受。

同种异体抗原是由来自属于相同物种的其它生物体的遗传物质所编码的任何分子。因为所述分子是不同的分子并被引入到另一生物体，后者的免疫系统被诱导而产生针对该“外源”物质的一系列反应。一个实例是一半遗传物质来自母本、一半遗传物质来自父本的新受精的胚胎；后一半对于母本的免疫系统而言可为外源的，因此它可能被母本的机体所排斥。母-胎免疫耐受(母本机体识别/接受胎儿，而不触发针对它的免疫应答的过程)的缺乏是早期流产(precocious abortion)的主要原因之一。

在农业领域中广泛使用的另一项生殖技术是人工授精(AI)，其在于通过适合于各雌性解剖特性的特定技术，将精液(精子/雄配子和精浆)人工放入雌性生殖道。根据已授精雌性数量，通过妊娠率-或受孕雌性数量来测定AI的成功。在该程序中，所产生的胚胎也包含50%来自父本的遗传物质(因此，不同于来自母本的遗传物质)，因此这也可导致形成大量的同种异体抗原并导致胚胎丧失，因为缺乏母-胎耐受。

另外，体内产生，然后胚胎移植(ET)，是这样的生殖技术：其中若干胚胎在供体雌性(其供给遗传物质)的生殖道中产生并被移植到同一物种的受体雌性的子宫，其将妊娠至足月。胚胎产生进入供体子宫涉及超数排卵(superovulation)、人工授精和胚胎冲洗(embryo flushing)技术。冲洗之后，评价胚胎并可将有活力的胚胎移植或冷冻保存。将体内产生的胚胎移植(放置)到受体的子宫或子宫角，取决于动情期的同步化过程(即，以将受体的子宫调整到胚胎发育的相同阶段)。在该程序中，移植到受体的机体内的胚胎包括至多100%同种异体抗原(alloantigen)(不同遗传物质)，因为它们完全由来自供体和来自父本的遗传物质组成，这暗示具有较高的胚胎丧失风险，因为缺乏母-胎耐受。

另一方面，体外受精，然后胚胎移植，涉及到在实验室内产生胚胎，并且将所述胚胎移植到同一物种的受体雌性子宫，其将妊娠至足月。胚胎的实验室产生取决于以下：(i) 通过超声引导的卵泡穿刺，从供体卵巢吸取卵母细胞；(ii) IVM – 卵母细胞的体外成熟，然后体外诱导卵母细胞的细胞质和卵母细胞核成熟，从而制备卵，用于受精；(iii) IVF - 体外受精或成熟卵母细胞和有能力的精子的配子配合过程；(iv) IVC – 受精后的胚胎体外培养，直到5-7天培养之后，所述胚胎到达合适阶段(桑椹胚和/或胚泡)，用于移植；(v) 胚胎移植，当培养期之后，应当评价胚胎并可将具有良好活力的那些进行移植、冷冻保存和/或玻璃化。体外产生的胚胎向受体的子宫或子宫角的移植，也取决于动情期的同步化过程(即，以将受体的子宫调整到胚胎发育的相同阶段)。在该程序中，在受体机体内生长(ovulated)的胚胎包括至多100%同种异体抗原(不同遗传物质)，因为它们完全由来自供体和来自父本的遗传物质组成，这暗示具有较高的胚胎丧失风险，因为缺乏母-胎耐受。

如上所述，母-胎耐受是一个免疫过程，其调节母本机体针对胚胎或胎儿的反应。机体的免疫系统负责针对可能损害其常规生理状态的外来因子和/或侵略者(aggressor)的一系列复杂反应。

妊娠期间的免疫调节反应为排卵、联合突和受精所致的事件，其首要目标在于孕体(胚胎或胎儿和有关的膜)的生长和发育。

在这个意义上，Lewis, S.K.等, 2007 (Galectin-15 [LGALS15]: A Gene Uniquely Expressed in the Uteri of Sheep and Goats that Functions in Trophoblast Attachment)观察到，在反刍动物中，处于MO期的胚胎(桑椹胚，介于4-6天之间)进入子宫并持续发育直至BL期(胚泡，介于6-7天之间)，其含有单层细胞，称为滋养外胚层细胞。绵羊在直至D12天(第12天)、或山羊在直至D15天(第15天)，其透明带破裂之后，胚胎停留在延伸期。在所述时期期间，滋养外胚层产生干扰素-tau (IFNT)，其继而负责抑制黄体溶解(黄体退化)。当黄体(卵泡)具有活性时，则维持孕酮(P4)的产生，然后准备子宫内膜(包被子宫壁的粘膜)用于最终的妊娠。该项研究也表明，P4和IFNT调节子宫内膜上皮中的半乳凝素-15转录。半乳凝素-15将在子宫环境起作用，因为所述半乳凝素参与孕体的滋养外胚层向子宫的子宫内膜的固定/粘附，因此刺激生物学反应，例如粘附和迁移，这些是胚泡延伸期期间的关键性事件，并且因此使妊娠发生。

第二方面(In a second moment)，按照Farmer, J.L.等, 2008 (Galectin-15 (LGALS15) Functions in Trophectoderm Migration and Attachment)的研究，半乳凝素-15刺激细胞增殖和抑制细胞凋亡，这两者都是植入期间的重要事件。其作者证明，尽管半乳凝素-15基因存在于绵羊(ovine)、山羊(caprine)和牛(bovine)物种中，但是半乳凝素-15的mRNA (信使RNA)仅在山羊和绵羊的延伸期表达，其表达因动情周期的时期不同而异。另外，注意到经子宫输注给予外源IFNT，仅增加了半乳凝素-15的基因表达，如果雌性接受P4处理的话，因此证明了需要同时使用IFNT和P4作为半乳凝素-15 mRNA转录的诱导物。

Satterfield, M.C.等, 2006 (Progesterone Regulation of Preim-plantation Conceptus Growths and Galectin-15 [LGALS15] in the Ovine Uterus (在绵羊子宫中，胚胎植入前孕体生长的孕酮调节和半乳凝素-15 [LGALS15]))得出结论是，P4诱导由子宫内膜所分泌的若干蛋白质的基因表达，例如半乳凝素-15和分泌的磷蛋白1 (SPP1)，这些被认为是孕体生存和生长、以及植入期期间细胞粘附的调节剂。在这个意义上说，Burghardt, R.C.等, 2009 (Enhanced Focal Adhesion Assembly Reflects Increased Mechanosensation and Me-chanotransduction at Maternal - Conceptus Interface and Uterine Wall During Ovine Pregnancy (在羊妊娠期间增强的粘着斑装配反映在母体-孕体界面和子宫壁处增加的机械传感和机械传导))的研究提到SPP1和半乳凝素-15在子宫环境-孕体界面上是机械传感器(mechano-sensor)。

按照另一条思路，Than, N.G.等, 2008 (Emergence of Hormonal and Redox Regulation of Galectin- 1 in Placental Mammals: Implication in Maternal-Fetal Immune Tolerance (半乳凝素-1在胎盘类哺乳动物中激素的出现和氧化还原调节: 在母-胎免疫耐受中的意义))所进行的一项研究得到的结论是，半乳凝素-1显示出高水平的结构保守性、二聚作用以及与碳水化合物和整联蛋白(粘附蛋白)的连接性质，表明这些性质在脊椎动物中是保守的并且在不同胎盘类型(无论是否是蜕膜)中维持标准的基因表达。其作者也观察到半乳凝素-1可将母体的免疫耐受性给予胎儿的同种异体抗原，调节子宫的天然杀伤(NK)细胞的作用，并起到T细胞调控和调节剂的作用(T细胞参与细胞免疫)。最终，其作者证实P4在子宫内膜刺激半乳凝素-1产生中的协同作用。

正是因为有了生育力(fertility)的研究，所以可确认半乳凝素的作用与免疫应答的调节、以及胚胎延伸和胚胎向子宫内膜的粘附相关。

半乳凝素已知是哺乳动物β-半乳糖苷凝集素的配体并且可由多种组织表达。这些凝集素通常是可溶性的并且不含肽信号，由独立于内质网和高尔基复合体的机制所分泌。至今为止，描述了15种哺乳动物半乳凝素，全都具有大约130个氨基酸残基的碳水化合物识别结构域。

已经知道半乳凝素与来自胞外空间的免疫系统细胞表面的聚糖之间的相互作用可调节细胞因子和介质的产生、细胞粘附、细胞凋亡、趋化作用和胞吞作用。在胞内环境中，半乳凝素可参与信号传导途径并调节某些生物学反应，例如细胞凋亡、细胞生长的调节和pre-mRNA剪接。

Farmer, J.L.等, 2008 (上述文章)也公开了，除了半乳凝素-15和半乳凝素-1之外，其它半乳凝素可由哺乳动物的子宫内膜和胎盘表达并且在子宫内膜分化、胚泡植入和滋养层分化中具有重要作用；同样，Poppovich等, 2005 (Galectin-9: a New Endometrial Epithelial Marker for the Mid- and Late-Secretory and Decidual Phases in Human (半乳凝素-9: 人体中的分泌和蜕膜期中晚期的一种新型子宫内膜上皮标记))公开了半乳凝素-9的性质，而Lee等, 1998 (Spa- tio-Temporal Pattern for Expression of Galectin-3 in the Murine Uteroplacental Complex? Evidence for Differential Regulation (半乳凝素-3在鼠子宫胎盘复合物中的空间-时间表达模式？差异调节的证据)涉及半乳凝素-3的表达。此外，文献中还有若干篇其它文章报道了重组半乳凝素或这些蛋白的特定抑制剂的潜在治疗性用途。

半乳凝素-1是参与例如以下生物学过程的一种多功能分子：粘附、增殖、分化和细胞周期；细胞凋亡；RNA剪接；炎性过程和适应性免疫应答的控制。内源半乳凝素-1表达已经在胸腺上皮细胞、经抗原初次免疫的(antigen-primed) T细胞、活化巨噬细胞、活化B细胞(参与体液免疫)、内皮细胞、基质细胞、以及鼠淋巴样器官例如胸腺和淋巴结中都观察到。鉴于其免疫调节性质，半乳凝素-1(内源或外源的)是预防胎儿丧失和/或胚胎死亡的重要介质。

半乳凝素-1可通过异源表达系统而得自哺乳动物(人、牛、绵羊、山羊、马和/或猪物种)，其呈活化、无菌、烷基化和无内毒素的形式。获取重组半乳凝素-1的方法在文献中已广为人知并且通常包括以下步骤：(i) 获取含半乳凝素-1的细菌的粗提取物；(ii) 纯化半乳凝素-1；(iii) 通过用碘乙酰胺烷基化而保护半乳凝素-1的凝集素活性；和(iv) 除去碘乙酰胺-烷基化半乳凝素-1制备物中的细菌内毒素(LPS)。在文献中所公开的用于在本实验中进行的测试的可能性中，我们已经根据以下程序产生半乳凝素-1。

获取重组半乳凝素-1的第一步开始于已转化有含半乳凝素-1基因的表达载体(优选pET29a质粒)的细菌培养(优选大肠杆菌(E. coli) rosetta菌株)，其在含50μg/mL氨苄青霉素(USB Corporation, USA)的200mL LB肉汤基础(LB Broth Base) (Invitrogen, Gibco, Carlsbad, CA, USA)上，在37℃下在定轨振荡器中以200rpm进行16-18小时。在此时期之后，将25mL该培养物转移至含500μl氨苄青霉素(50μg/mL)的1 L先前已经高压灭菌LB的一半。此外，将该细菌悬液在37℃在定轨振荡器中以200rpm再次孵育另外2小时。在600nm处，最佳细菌生长率显示光密度(OD)范围介于0.5-0.5。此外，将稀释到1mL LB的一半中的0.36g异丙基-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG, Promega, WI, USA)加入到该培养物内，以诱导经转化细菌的半乳凝素-1表达。再一次在振荡器(37℃ – 250-300rpm)中进行培养，达4小时。在此时期之后，将细菌悬液在4℃以5000g离心15-20分钟，将培养物沉淀再次在4℃以3000g离心15-20分钟。最终，将上清液弃去并将沉淀贮存在-80℃直至使用时。

获取重组半乳凝素-1的第二步从细菌沉淀继续进行，将其在冰浴中进行融化并将其在含有以下成分的裂解缓冲液中进一步重悬浮：7ml PBS (磷酸缓冲盐水-NaCI (136.8mM)；KCI (2.7mM)；Na2HPO4 (6.4mM)；KH2PO4 (0.9mM, pH 7.4)；14mM 巯基乙醇(2-ME) (Merck-Schuchardt, Germany), 1片无EDTA的蛋白酶抑制剂(Roche Diagnostics GmbH, M, Germany), 1mL溶菌酶-1 mg/ml_ (Roche Diagnostics GmbH, M, Germany), 10μL_ RNA酶A型3A - 10mg/mL (Sigma-Aldrich)和10μL_ DNA酶I型IV - 10mg/mL (Sigma-Aldrich)，然后在冰浴中与裂解缓冲液一起进行孵育，达30分钟。此外，样品在40W (Sonics Vibra cell；SONICS & MATERIALS INC.)经超声处理5个循环，每循环20秒；每循环之间，让悬液静置15秒。然后将细菌裂解液在4℃在10,000g离心45分钟。然后收集上清液并在5ml床体积的琼脂糖-乳糖柱(Sigma-Aldrich)上进行亲和色谱。用平衡缓冲液(PBS, 从2-ME加至14mM, pH 7.4)洗脱非配体，并收集20个流分(2mL)。用洗脱缓冲液(含14mM乳糖, pH 7.4)洗脱亲和柱配体，并收集10个流分(0.5mL)。色谱程序通过在280nm处的吸光度读数(UV Mini 1240, Shimadzu)和聚丙烯酰胺凝胶电泳而监测。半乳凝素-1溶液中的蛋白浓度通过使用在280nm处的吸光度读数的光谱法或市售可用的比色测定法来测定，并表示为每毫升中蛋白的毫克数(mg/mL)。通过在琼脂糖-乳糖上纯化半乳凝素-1的该过程而获取的色谱流分通过电泳(SDS-PAGE - "十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳")进行分析。将在还原和离解缓冲液(终体积20μL)中含有的样品上样到聚丙烯酰胺凝胶(15%)并在恒定电压(150V)下进行电泳运行。粗细菌裂解液的色谱流分和非配体材料用作样品。对于对照，使用已知分子量的标准品(LMWH–用于电泳的低分子量校准试剂盒-GE, Amersham - Biosciences, Uppsala, Sweden)。用“考马斯亮蓝”对凝胶进行染色。将得自琼脂糖-乳糖色谱的半乳凝素-1溶液保持在洗脱缓冲液中，目的是保持该蛋白的凝集素活性，并贮存于-80℃直至使用时。对于测定，按照制造商的使用说明(Sephadex-G25M；Pharmacia LKB, Uppsala, Sweden)，将这些溶液在PD10柱中通过分子排阻色谱而进行脱盐。半乳凝素-1脱盐溶液的浓度通过如上所述的光谱法或比色反应而测定。为了评价凝集素活性(半乳凝素-1识别糖的能力)在琼脂糖-乳糖树脂中纯化的半乳凝素-1中的保持水平，将该蛋白样品在PD-10柱中脱盐并立即在琼脂糖-乳糖柱中再次色谱分离。收集20个流分，每个1.0 mL。洗脱过程借助蛋白浓度(mg/mL)来监测。在这最后程序中，用洗涤缓冲液对半乳凝素-1的洗脱，被认为是该蛋白的凝集素性质损失的指示物，因为在这样的条件下，半乳凝素-1不能识别乳糖并因此不能保留在琼脂糖-乳糖树脂中。半乳凝素-1的巯基的氧化及其变性可能促使该蛋白的凝集素活性损失，该性质与该分子的若干功能相关。考虑到纯化半乳凝素-1溶液贮存在-80℃和在使用之前应当融化，所以应当评价所述程序对该凝集素的血凝活性的影响。血凝在半乳凝素-1特异性半抗原糖即乳糖(20mM)存在或不存在时发生。仅在不大于2μM的浓度时表现出血凝活性的半乳凝素-1制备物用于不同测定。

制备重组半乳凝素-1的第三步包括通过血凝和/或有可能测定这些重组半乳凝素-1制备物的凝集素特性的保持的其它方法，控制该凝集素的烷基化制备物的凝集素活性。半乳凝素-1的巯基的氧化促使该蛋白的凝集素活性的变性和损失。因此，为了获取更稳定的半乳凝素-1样品，该凝集素的制备经历了用碘乙酰胺的烷基化，碘乙酰胺是一种还原性化合物，其以共价方式与巯基反应，由此产生羧基氨甲基-半乳凝素-1 (烷基化半乳凝素-1)。简而言之，在100mM乳糖存在下，0.037g碘乙酰胺(蛋白-碘乙酰胺, Sigma-Aldrich；终浓度20 μM)稀释在1.0ml纯化半乳凝素-1溶液中。然后，将该溶液在冰浴中孵育，避光，16-18小时。孵育之后，所述溶液在PD10中进行分子排阻色谱，以除去游离碘乙酰胺和乳糖。烷基化半乳凝素-1制备物的浓度经光谱法测定并表示为mg/mL，如上所述。

制备重组半乳凝素-1的第四步涉及细菌内毒素(LPS)的去除。考虑到半乳凝素-1得自在其细胞壁组成中具有LPS (脂多糖)的革兰氏阴性菌，所以在用碘乙酰胺烷基化的步骤之后，半乳凝素-1制备物在Polymixin B-琼脂糖柱(Detoxi-Gel Endotoxin Removing Gel, Pierce, IL, USA)上进行亲和色谱。通过使用QCL-1000试剂盒(Chromogenic Limulus Amebocyte Lysate Assay, Cambrex Company, MD, USA)测定LPS内毒素的量，评价从烷基化半乳凝素-1制备物中去除LPS的的程序的有效性。然后对具有活性且无内毒素的烷基化半乳凝素-1制备物进行过滤除菌(0.22μm膜)。

因为制备重组半乳凝素-1的方法已经公开，应当注意的是，可借助非常类似的程序获取任何其它β-半乳糖苷-结合凝集素或其衍生物。

因此，已知半乳凝素-1在体内和体外系统中，在调节免疫病症、抑制炎性反应和调节T细胞功能中起到重要作用，专利申请US 12/175,227公开了调节所述凝集素的免疫应答的方法，以预防和治疗免疫病症，包括霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma)。

关于与其它分子和/或细胞的相互作用的潜力，已知在半乳凝素-1的存在下，树突细胞变为致耐受性的(tolerogenic)并且能够调节哺乳动物的免疫应答，预防自身免疫性疾病的发展，以及逆转移植排斥。在这个意义上，US 12/137,004专利申请公开了在所述凝集素的存在下制备包含树突细胞的制剂的方法，其目的是治疗肿瘤和自身免疫性疾病和感染性疾病。

Blois, S.M.等, 2007 (A Pivotal Role for Galectin -1 in Fetomaternal Tolerance (半乳凝素-1在胎儿母体耐受中的关键作用))的研究基于实验性治疗模型的结果，其中将半乳凝素-1经腹膜内给予同基因小鼠，以评价由噪声暴露所致的应激-诱导的胎儿丧失。注意到小鼠子宫中的半乳凝素-1表达对环境改变高度敏感，因此损害了雌性的妊娠，导致应激。另一方面，当小鼠经重组半乳凝素-1处理，胎儿丧失的发生率显著下降。

已知为了维持妊娠，母体的机体经历相当的变化，包括激素和免疫改变。有证据表明子宫内膜为胚胎植入所做的准备不仅是激素刺激的问题，它取决于胚泡与子宫内膜之间的相互作用，并且它也由细胞因子、生长因子和粘附分子(其由子宫内膜和胚泡产生和分泌)介导。即使如此，不同生理体系之间的相互作用可导致妊娠失败，这不能仅通过孤立的因素来解释。

从农业市场的观点看，由交配或人工授精所得到的妊娠中的母-胎免疫耐受的机制在生殖兽医学上仍然是一项挑战(考虑到针对胎儿同种异体抗原的免疫应答)。

在这一方面，应当注意的是妊娠失败产生经济损失，对于养殖者而言是严重后果，这继而必须维持生殖有效性的令人满意的水平，以满足消费者的要求并维持其所拥有的所有物的利润率。

另外，乳牛和肉牛养殖者通常使用生殖技术，以限定受精后的胚胎性别。然而，体外产生并被进一步移植到受体子宫内的胚胎并未显示出令人满意的存活率，这是由于主要由维持培养基所致的形态和结构改变，其引起早期胚胎丧失(precocious embryo loss)。

此外，生殖生物技术的商业使用的限制之一是雄性(精液)或雌性(卵母细胞)供体的配子、或者体内或体外产生的胚胎的采集和放置地点之间所包括的距离。已经知道，细胞功能的保持直接涉及到pH和温度变化(除了其它性质之外)，因此将其维持在最佳条件下直至胚胎移植时，是一项挑战。

鉴于前述，本发明公开了用于目前主要存在于农业市场的生殖困难的解决方案，其主要目的是如下促进母体子宫中胚胎植入率增加：给哺乳动物子宫提供有效量的β-半乳糖苷-结合凝集素或其衍生物。

发明目的

本发明的目的是使用有效量的β-半乳糖苷-结合凝集素或其衍生物，优选由半乳凝素-1、半乳凝素-3、半乳凝素-9、半乳凝素-13或半乳凝素-15或其衍生物组成的组的成员，以在牛、猪、绵羊、山羊、马、水牛(buffaline)、犬、猫和人物种(除了其它物种之外)中增加母体子宫中的胚胎植入率，因而阻止母体免疫系统对胚胎的消除。

本发明的另一目的是通过借助人工授精、体外或体内胚胎移植、或交配向哺乳动物的生殖道转移β-半乳糖苷-结合凝集素或其衍生物，而增加哺乳动物子宫中的胚胎植入率。

此外，本发明的一个目的是使用有效量的β-半乳糖苷-结合凝集素或其衍生物，以促进以下的受精：(i) 新鲜的、冷藏的或冷冻的精液；(ii) 新鲜的、冷冻的或经玻璃化的卵母细胞；和(iii) 新鲜的、冷冻的或经玻璃化的胚胎，其来自胚胎移植或体外受精、或克隆的或转基因的胚胎。

本发明的另一目的是提供β-半乳糖苷-结合凝集素或其衍生物，以增加哺乳动物子宫中的胚胎植入率。

最后，本发明的一个目的是使用包含有效量的β-半乳糖苷-结合凝集素或其衍生物的产品，以增加哺乳动物子宫中的胚胎植入率。

发明简述

本发明的目的通过以下方式而实现：

(a) 通过给予哺乳动物子宫有效量的β-半乳糖苷-结合凝集素或其衍生物，增加哺乳动物子宫中的胚胎植入率的方法；

(b) 有效量的β-半乳糖苷-结合凝集素或其衍生物用于增加哺乳动物子宫中的胚胎植入率的用途；

(c) 用于增加哺乳动物子宫中的胚胎植入率的β-半乳糖苷-结合凝集素或其衍生物；和

(d) 用于增加哺乳动物子宫中的胚胎植入率的包含有效量的β-半乳糖苷-结合凝集素或其衍生物的产品。

发明详述

在本发明中，植入率涉及在受精(雌配子和雄配子结合)之后实际粘附到哺乳动物子宫内膜上的胚胎数量，无论其是否通过辅助生殖技术而产生。

本发明的目的通过以下方式而实现：通过子宫或阴道途径向哺乳动物母体的子宫提供有效量的β-半乳糖苷-结合凝集素或其衍生物在常规缓冲液中的活性形式，单独或者与维持培养基中的精子、卵母细胞或胚胎混合。

缓冲液旨在维持、处理和转移精液、卵母细胞或胚胎，并且其优选为由盐水缓冲溶液(磷酸缓冲盐水-PBS)或无菌的、稳定的、无内毒素的、等渗生理血清组成的载体，其pH介于6.8至7.4之间。

维持培养基是在大气下依照温度而将胚胎维持不同时间的复杂和无血清的培养基。维持培养基通常由等渗缓冲液组成，所述等渗缓冲液含有必需氨基酸、生长因子、酶、能量基质、细胞营养物和抗生素。

维持培养基的一个实例是稀释剂，即添加到精液中或与精液混合、以保持精液受精能力的稀释液体。用于冷冻的具体稀释剂也具有低温学性质(cryogenic property)，从而使得能够转运、冷冻和融化。稀释剂由等渗缓冲液、能量基质和细胞营养物、抗生素、抗氧化剂和冷冻保护剂组成。

本发明的目的也可通过以下而实现：通过以同时或序贯方式将β-半乳糖苷-结合凝集素或其衍生物、以及精液、卵母细胞或胚胎给予哺乳动物的子宫(这些步骤将会进一步定义)。

本发明所提供的某些优势如下：增加牲畜的生殖效率；在质量和数量上改良后代；缩短出生到宰杀之间的时间长度；减少饲喂成本；增加杂合的可能性；在处理上的改进和降低技术、健康和生殖费用；其它方面随后在本文中描述。

本发明包括β-半乳糖苷-结合凝集素或其衍生物、优选半乳凝素-1、半乳凝素-3、半乳凝素-9、半乳凝素-13和半乳凝素-15用于增加哺乳动物子宫中的胚胎植入率的用途。

借助生殖生物技术增加哺乳动物子宫中的胚胎植入率，直接反映了使用这样的程序作为遗传进步的工具的可行性，考虑到其将技术的结果和/或成功提高至经济上可行的水平。

另外，更好的是，在生殖生物技术中使用来自遗传上优良个体的遗传物质，因为其最大化地传播了这些动物并为明显优良的个体的不足提供了备选。生殖生物技术也允许缩短世代间隔。

另外，当今的全球性挑战之一是在世界范围内征服饥饿，这个世界上可耕地面积持续缩小并且在下一个25年内估计有50%人口增长。因此，在牛、猪、绵羊和其它物种中增加母体子宫的胚胎植入率，意味着在整体上增加食物产量，包括肉产量，估计在下一个25年内对其产量的需求翻倍，达到每年超过1.27亿吨。

在生产性兽群中增加哺乳动物子宫的胚胎植入率的影响如下：

- 后代在质量和数量上的改良- 在肉牛中，在体重和质量两方面 – 增加日增重，提高大理石纹品质、柔嫩度、肉香味，并且也提高初次切割(prime cut)的产量，这为终产品增加更多价值。在乳用兽群(dairy herd)中，这提供了增加的生产率和提高的奶质量。

- 其还提供了缩短的直至宰杀的时间长度，即因遗传改良而获得的增加的日增重缩短从出生到宰杀的时间长度达30%。因此，动物的早期生长明显增加。

- 减少饲喂成本：尽管增加了为达到优良遗传品质所需的投资，但在降低动物生产成本上有不仅仅令人满意的考虑，主要是因为增加了早熟性(precocity)，这缩短了直至宰杀的时间长度。鉴于以上，生产成本降低至少10%。

- 增加杂合的可能性：使不适应巴西热带气候但在兽群的畜体、早熟性和生产力方面提供改良的牛品种杂交变得更可行。

- 在处理上的改进和降低技术、健康和生殖费用：使用生殖生物技术提供更好的健康条件，因为这预防了性传播疾病在牛中的扩散，减少了治疗疾病的药物的费用，并因此减少了生产成本。

更具体地讲，本发明是对在母牛中体内产生的胚胎移植的试验结果，以证明在半乳凝素-1存在下哺乳动物子宫中胚胎植入率的增加。

实施例

通过子宫途径，将单次100μg剂量的22μL无菌的、具有活性的、烷基化的和无内毒素的重组人半乳凝素-1给予胚胎受体。应当注意的是，以上剂量与牛体重相比显著低，并且对所处理的雌性的生物安全方面是有利的，这不像小鼠(通常用作实验动物)，其机体已为一次单胎妊娠做好准备。

为了评价半乳凝素-1作为调节剂在哺乳动物生育力中的效果，我们在正常处理条件下使用非同基因的、受限制的动物(confined animal)。

供体母牛经历超数排卵并在受精D0 (第0天)授精。平行地，受体经历动情期同步方案，以在D0排卵。

在D7 (第7天)，供体进入收集期并对处于桑椹胚和/或胚泡期的胚胎进行评价。将差(3级)、良(2级)和优(1级)胚胎装瓶，以便在同一天移植给受体，所述受体先前已根据黄体发育而进行选择。

一般而言，根据形态学参数进行胚胎分类，并包括按其发育阶段所鉴别的3个主要阶段。最好的是，胚泡不应具有可见的碎片，并且细胞应当具有均匀的大小。还应当注意的是，并非所有具有优良形态学的胚胎内部都健康，因为它们经受了涉及到卵子(ovule)、精子和受精过程本身的条件。

将在TQC^?维持培养基柱上的胚胎和在另一柱上的稀释在无菌生理血清中的半乳凝素-1 (胚胎在装瓶时不接触半乳凝素溶液)装瓶在同一吸管(straw)中并借助于授精移液管转移到与供体同步化的受体子宫中。将吸管全部内容物一次转移，并且在该实施方案中，胚胎和半乳凝素-1以单独和同时的方式到达受体子宫。

试验目的是分析在胚胎移植日期之后第30和60天时在以下受体中的哺乳动物子宫中经确认的胚胎植入数量：(i) 接受半乳凝素-1局部处理的受体，(ii) 不存在半乳凝素-1时的移植胚胎的受体。为此，将移植胚胎的受体分为2个不同组，用于分别交配(供体 x 精液)，如下：对照组(半乳凝素-1不存在时的胚胎)，和处理组(半乳凝素-1存在时的胚胎)。

在两个不同时刻，在处理组和对照组中都通过超声检查而进行妊娠诊断：第一次测量在胚胎移植之后30天进行(在下表中表示为"P30")，而第二次评价哺乳动物子宫的胚胎植入率是在胚胎移植之后60天进行(在下表中表示为"P60")。

方法学：

受体是产奶良好和生殖率已知的母牛。受体是产奶量高和生殖率已知的荷斯坦母牛(Holstein female)。

用于交配选择的程序是指为各供体选择繁育动物(精液剂量)。收集和评价胚胎之后，将大约半数所产生的胚胎移植到属于对照组的受体子宫，而另一半数胚胎则移植到属于处理组的受体子宫。按照对照组和处理组之间所显示的品质等级，试图等量分配胚胎，以便使这两组可比较。

方法学：对照组

按照对这类事件的传统方法，在对照组中进行胚胎移植程序：即胚胎移植发生在受体的黄体(其中排卵发生在动情期)同侧的子宫角。所用的吸管，由3个主要柱组成，包装一个TQC^?维持培养基柱，接着是空气柱，接着是含胚胎的TQC^?维持培养基柱，接着是另一空气柱，接着是另一TQC^?维持培养基柱。将吸管的全部内容物一次转移。

方法学：处理组

按照传统方法，在处理组中进行胚胎移植程序，即胚胎移植发生在受体的黄体(其中排卵发生在动情期)同侧的子宫角。所用的吸管由3个主要柱组成，包装一个TQC^?维持培养基柱，接着是空气柱，接着是含胚胎的TQC^?维持培养基柱，接着是另一空气柱，接着是含有半乳凝素-1的另一维持培养基柱。将吸管的全部内容物一次转移，并且在该实施方案中，胚胎和半乳凝素-1以单独和同时的方式到达受体子宫。

结果：在以下两个说明性表格中，左边的第一列(重复)表示各母牛所产生的胚胎移植的重复，相当于总共12次重复。同时，将另外两列细分，以区分关于对照组和处理组所获得的结果，接着是另外两列，显示在程序中使用半乳凝素-1所得到的受体子宫中的额外的胚胎植入率之间的关系。

对应于“数量控制”的列表示在半乳凝素-1不存在时由胚胎移植所产生的胚胎数量。将右边随后一列(对照P30)细分，以显示以下两者：胚胎移植之后30天的植入数量(数量30)，关于相同时间周期期间对应于植入率的相应百分率(T30)。同样的推理用于右边随后一列(对照P60)，经细分，以显示胚胎移植之后60天的植入数量(数量60)以及相同时间周期期间对应于植入率的相应百分率(T60)。

对应于"经处理数量"的列表示在半乳凝素-1存在时由胚胎移植所产生的胚胎数量。将右边随后一列(经处理P30)细分，以显示以下两者：胚胎移植之后30天的植入数量(数量30)，关于相同时间周期期间对应于植入率的相应百分率(T30)。同样的推理用于右边随后一列(经处理P60)，经细分，以显示胚胎移植之后60天的植入数量(数量60)以及相同时间周期期间对应于植入率的相应百分率(T60)。

将对应于"Δ植入率"的列细分，以表示对照组和处理组P30 (Δ30)所得的植入率的差异，以及对照组和处理组P60 (Δ60)所得的植入率的差异。

表格: 

表1：分别在30天和60天之后，来自对照组(半乳凝素-1不存在时的胚胎移植)和处理组(半乳凝素-1存在时的胚胎移植)的1、2和3级胚胎的植入率结果。

如表1所示，总结果分析表明，胚胎移植之后30天，处理组显示出较高的母体子宫植入率，其植入率为60.3%，而对照组为43.7%。对胚胎移植之后60天的最终结果进行分析表明，处理组的母体子宫植入率为50%，而对照组为35.9%。

根据表1的结果，可以得出的结论是，使用半乳凝素-1增加母体子宫的胚胎植入数量在30天之后达16.7百分率点，在60天之后达14.1百分率点。

表2：仅考虑来自对照组(半乳凝素-1不存在时的胚胎移植)和处理组(半乳凝素-1存在时的胚胎移植)的2级胚胎，分别在30天和60天之后的植入率结果。

表2所列结果表明，在2级胚胎的胚胎移植之后30天，处理组具有较高的母体子宫植入数量，其植入率为56.8%，而对照组获得的植入率为41.3%。对2级胚胎移植之后60天的最终结果进行分析表明，处理组的母体子宫植入率为48.6%，而对照组为33.9%。

根据表2所示的结果，可以得出的结论是，提供给处理组的牛受体子宫的半乳凝素-1增加植入数量在30天之后达15.5百分率点，在60天之后达15.3百分率点，增加了牛子宫的2级胚胎的植入率。

考虑到在本实验中，重组人半乳凝素-1在母牛子宫中起到抗原作用，主要是因为它来自不同物种，进行了研究以证明：(i)来自相同物种的半乳凝素与聚糖之间的更大的相互作用，和因此，(ii) 半乳凝素-1在增加哺乳动物母体子宫的胚胎植入率中的更好的表现。

由半乳凝素-1所触发的、可增加哺乳动物子宫的胚胎植入率的生理机制仍然还在研究之中，因为已移植了胚胎的牛受体的妊娠尚未到达足月。

在牛中，胎盘具有众多不同大小和形状的单元，其在于相互交叉的胎儿绒毛隆起(swell)与在子宫内再次联合的cryptform内陷。为了维持妊娠，胚胎必须通过产生IFNT而向子宫环境发送它存在的信号而参与。因此，黄体溶解仍然受到抑制，并且，因此P4水平一直保持高的。因此，IFNT和P4两者刺激mRNA以增加子宫内的半乳凝素水平。在母体环境识别和接受胚胎之后，滋养层细胞分化并与子宫上皮细胞联合，因而得以直接接触母体组织。

因此认为，半乳凝素-1参与涉及免疫耐受机制的调节和/或促进胚泡延伸和胚胎在子宫内膜粘附的过程，这就解释了哺乳动物母体子宫的胚胎植入率增加。

本发明进一步公开了β-半乳糖苷-结合凝集素或其衍生物，优选选自半乳凝素-1、半乳凝素-3、半乳凝素-9、半乳凝素-13或半乳凝素-15或其衍生物可用作药剂以调节精液、卵母细胞或胚胎的生育力，从而增加哺乳动物子宫的胚胎植入率。

提供给哺乳动物母体子宫的β-半乳糖苷-结合凝集素或其衍生物的量可根据物种体重而变化，并且其浓度比率应优选为0.0000001至1.0 mg/千克哺乳动物体重的范围。

在一个实施方案中，将β-半乳糖苷-结合凝集素或其衍生物稀释在缓冲液、优选磷酸缓冲盐水(PBS)或生理血清中，并且其借助混合有保持在维持培养基(在处理、转运、冷冻和融化期间能维持细胞生存和生物学完整性)中的精液、卵母细胞或胚胎的常规吸管而提供给子宫，使得吸管的全部内容物一次提供给哺乳动物子宫。

在一个优选的变化形式中，将β-半乳糖苷-结合凝集素或其衍生物在两个步骤中包装，以分离的方式和在精液、卵母细胞或胚胎之后，并且，在该程序中，使用2个填充吸管。在第一个应用中，将精液、卵母细胞或胚胎放入维持培养基并包装在常规吸管内，使得将所有内容物都提供给哺乳动物的子宫。在第二个应用中，将稀释在缓冲液中的β-半乳糖苷-结合凝集素或其衍生物包装在不同吸管中，并随后将其提供给哺乳动物的子宫。提供β-半乳糖苷-结合凝集素或其衍生物与提供精子、卵母细胞或胚胎之间的时间间隔(lapse)将基本上取决于所处理的哺乳动物物种和所用的处理方法并且按照所采用的处理可延长多达17天。

还公开了将稀释在缓冲液中的β-半乳糖苷-结合凝集素或其衍生物包装在给定常规吸管的柱中，间插在含有在维持培养基中的精子、卵母细胞或胚胎的其它柱之间，使得将吸管的所有内容物随后提供给哺乳动物的子宫。

在所提供的所有变化形式中，将β-半乳糖苷-结合凝集素或其衍生物，以及精液、卵母细胞或胚胎通过子宫或阴道途径给予。精液可以是新鲜的、冷藏的或冷冻的；卵母细胞可以是新鲜的、冷冻的或经玻璃化的；和胚胎可以是新鲜的、冷冻的或经玻璃化的，并且也可来自胚胎移植、体外受精、以及克隆或转基因的胚胎。

此外，已经知道体外胚胎产生系统允许在受精之后判定胚胎性别，因此所述系统是奶牛和肉牛养殖者的重要工具。然而，体外产生的胚胎在哺乳动物子宫中并未显示令人满意的存活率。因此，本发明提供调节精液、卵母细胞或胚胎的生育力的解决方案，从而增加了哺乳动物子宫的胚胎植入率。

另一方面，生殖生物技术的商业应用的限制之一是精液、卵母细胞或供体胚胎的采集地点与受体物种所在地点之间所经过的距离；以及分隔供体物种与受体物种的距离。在这个意义上说，冷冻保藏(冷冻过程)和玻璃化(超快的冷冻方法)在动物生产中已经变成惯例。然而，尽管冷冻保藏和玻璃化技术具有商业优势，但是在冷冻期间，精子在膜、早期能力、DNA改变和氧化应激上可遭受改变，这损害其生育力。

在一个优选的实施方案中，本发明公开了包含有效量的β-半乳糖苷-结合凝集素或其衍生物的产品在增加哺乳动物子宫的胚胎植入率中的用途。

由于已公开了优选实施方案的若干实例，应当理解，本发明的范围包括其它可能的实施方案并且它仅受到所附权利要求书、包括其中可能的等同方案的内容的限制。