TMEM63A在捻转血矛线虫半乳糖结合凝集素调节山羊外周血单个核细胞功能中的作用

摘要

捻转血矛线虫是牛羊等反刍动物重要的肠道寄生性线虫。它寄生在牛羊等宿主动物真胃及小肠内，靠吸食宿主血液为生。感染捻转血矛线虫能够引起宿主免疫功能低下，造成宿主贫血、消瘦及死亡，死亡多发生于羔羊。给世界范围内畜牧业造成重大经济损失。
　　Hco-gal-m(Acc.No.AY253330)和Hco-gal-f(Acc.No.AY253331)是由本实验室首次发现，分离，体外克隆表达的，分别来自于捻转血矛线虫雌虫和雄虫的半乳糖结合凝集素。本实验室目前研究表明，重组Hco-gal-m/f(rHco-gal-m/f)能够以剂量依赖方式诱导细胞凋亡，降低细胞迁移能力，减少氧自由基释放，降低NO产量和细胞因子水平。当用rHco-gal-m/f免疫山羊时，会出现粪便内虫卵量降低，山羊体内虫体减少，IgG水平上升等变化。而跨膜蛋白63A(TMEM63A)是Ⅳ型跨膜蛋白。进一步研究证明，TMEM63A在大多数山羊外周血单个核细胞上表达，参与细胞因子调节。然而，目前TMEM63A只在为数不多的几种哺乳动物上发现，其功能均未知。本实验室通过大量实验证实了TMEM63A是捻转血矛线虫半乳糖结合凝集素在山羊外周血单个核细胞上的受体或结合蛋白。本文使用抗体封闭技术、RNA干扰技术研究TMEM63A对Hco-gal-m/f调节PBMCs（单核细胞）增殖、迁移、吞噬以及NO分泌功能的影响。
　　1.TMEM63A-Ⅰ原核克隆表达
　　由于TMEM63A是一个多次跨膜蛋白，且疏水性较强，不能以整体的形式在原核表达系统中表达。我们选择TMEM63A最长膜内区片段TMEM63A-Ⅰ作为目的片段进行克隆表达。TMEM63A-Ⅰ全长648bp。对其进行生物学信息分析，发现此片段疏水性较弱，有B细胞作用位点。首先将TMEM63A-Ⅰ重组进入pMD18-T载体，用以TMEM63A-Ⅰ基因片段保存。经测序分析，发现载体中TMEM63A-Ⅰ基因片段与NCBI中该片段同源性达100％。随后，构建表达载体pET-28a-TMEM63A-Ⅰ，并将其转化入宿主菌BL21，构建表达菌株BL21-pET-28a-TMEM63A-Ⅰ。用IPTG诱导5h，收集菌液。SDS-PAGE分析显示，表达蛋白25KD大小，存在于包涵体中。用镍柱纯化蛋白。
　　2.多克隆抗体制备
　　用肠激酶切去纯化后蛋白上的载体标签，收集无标签纯化蛋白，测浓度后分装保存。用无标签纯化蛋白与弗氏佐剂混成乳浊液，多次免疫大鼠。收集免疫大鼠血清，用饱和硫酸铵纯化法纯化多克隆抗体anti-63-IP。用免疫共沉淀方法验证多克隆抗体anti-63-IP的特异性。Western blot结果显示，anti-63-IP能够特异性识别天然构象TMEM63A。用间接ELISA方法检测多克隆抗体效价。
　　3.TMEM63A在Hco-gal-m/f调节PBMCs功能中的影响
　　抗体封闭技术实验结果显示，单独用40μg/mLHco-gal-m/f与PBMCs（或单核细胞）共孵育，同单独细胞对照组相比，PBMCs（或单核细胞）的增殖能力、NO分泌能力、迁移能力被抑制。说明Hco-gal-m/f可以抑制PBMCs（或单核细胞）的增殖能力、NO分泌能力和迁移能力。用浓度为2ug/mL的TMEM63A特异性抗体anti-63A IgG和40μg/mLHco-gal-m/f与PBMCs（或单核细胞）共孵育，同用40μg/mLHco-gal-m/f共孵育组相比，PBMCs（或单核细胞）的增殖能力、NO分泌能力、迁移能力明显提高，但与单独细胞对照组相比，PBMCs（或单核细胞）的增殖能力、NO分泌能力、迁移能力变化不明显。用浓度为2ug/mL的非特性性抗体Neg A IgG和40μg/mLHco-gal-m/f与细胞共孵育，同40μg/mLHco-gal-m/f共孵育组相比，细胞增殖能力、吞噬能力、NO分泌能力、迁移能力无显著改变。说明特异性抗体anti-63A IgG可以阻断Hco-gal-m/f与受体TMEM63A的结合，进而阻断Hco-gal-m/f对细胞功能的影响。RNA干扰技术研究结果显示，用特异性TMEM63A干扰RNATMEM63A-siRNA-1处理细胞后与40μg/mLHco-gal-m/f共孵育，细胞增殖能力、NO分泌能力、迁移能力的变化趋势与抗体处理趋势相一致，但差异不显著。上述结果表明，细胞TMEM63A是Hco-gal-m/f的受体或结合蛋白，对Hco-gal-m/f调节细胞功能具有重要影响。

目录

声明

论文说明

摘要

前言

第一章 半乳糖结合凝集素及其受体

1 galectins的结构分类

2 galectins的分泌和分布

2．1 galectins的分泌

2．2 galectins的分布

3 galectins的转运机制

4 galectins的免疫调节、免疫保护功能

4．1 调节细胞生长

4．2 诱导细胞凋亡

4．3 调节细胞迁移、粘附

4．4 调节肿瘤微环境

4．5 调节细胞信号传导

5 捻转血矛线虫galectins

5．1 捻转血矛线虫galectins的家族成员

5．2 捻转血矛线虫galectins的发育表达

5．3 捻转血矛线虫galectins的功能

6 galectins与其受体

参考文献

第二章 TMEM63A-I基因克隆、表达及蛋白纯化

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果

2．1 山羊外周血单个核细胞总RNA的含量及纯度

2．2 TMEM63A-I基因的克隆

2．3 TMEM63A-I基因序列分析

2．4 pET-28a-TMEM63A-I表达载体鉴定

2．5 重组蛋白的诱导表达及纯化

3 讨论

参考文献

第三章 63-IP重组蛋白抗体制备及效价测定

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果

2．1 切去蛋白标签

2．2 多克隆抗体制备及其特异性的验证

2．3 多克隆抗体效价的测定

3 讨论

参考文献

第四章 TMEM63A在捻转血矛线虫半乳糖结合凝集素调节山羊外周血单个核细胞功能中的作用

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 实验结果

2．1 RNA干扰技术研究TMEM63A蛋白在Hco-gal-m／f调节PBMCs功能中的影响

2．2 抗体封闭技术研究TMEM63A蛋白在Hco-gal-m／f调节PBMCs功能中的影响

3 讨论

参考文献

全文总结

附表

致谢