白藜芦醇在β-淀粉样蛋白诱导PC12细胞损伤中的保护作用及其机制的实验研究

摘要

阿尔茨海默病是老年人中最常见的神经退行性病。该病的主要病理学特征为脑内神经元斑块沉积和神经原纤维缠结，并引发神经突触和脑内神经元缺失。随着世界人口的老龄化加剧，阿尔茨海默病的发病率日趋上升，已成为当前老年医学面临的最为严峻的问题之一，然而，目前尚不清楚神经元退变损伤的分子机制，临床上对阿尔茨海默病亦缺乏有效地治疗手段。
　　 研究表明，β-淀粉样蛋白（β-amyloidprotein，Aβ）的沉积是阿尔茨海默病的始发因素和关键环节，是脑内神经元纤维缠结、神经元丢失的直接因素。Aβ可导致神经元损伤，诱导细胞凋亡。因此，降低Aβ细胞毒性、抑制Aβ异常沉积已成为研究阿尔茨海默病发病机制，寻找治疗方法的关键点。近年来有关中药治疗阿尔茨海默病的研究越来越多。白藜芦醇是一类广泛存在于葡萄、虎杖等植物中的多酚类化合物。具有抗氧化、抗炎症、抗癌及抗衰老等作用。最近的研究发现，白藜芦醇对H2O2、MPP、Aβ及6-羟多巴胺诱导的神经元损伤中都有一定的保护作用，并能够有效延缓阿尔茨海默病和亨汀顿舞蹈症的认知、学习、记忆与行为功能障碍。白藜芦醇对神经元的保护作用已经引起神经科学家的广泛关注。
　　 白藜芦醇可以通过调控多个基因和信号通路而发挥神经保护的作用。研究发现，白藜芦醇能诱导沉默信号调控因子(Silencesignalregulatingfator1，SIRT1)的高表达，从而引起一系列信号通路的改变。SIRT1是沉默信号调控因子sir-2的同源物，它参与基因转录、延长复制周期、能量代谢及延缓细胞衰老等生物过程。在阿尔茨海默病模型大鼠研究中发现，大鼠脑内SIRT1高表达能增强淀粉样前体蛋白(Amyloidprecursorprotein，APP)的非淀粉样蛋白分解途径，减少Aβ的沉积。
　　 在SIRT1对阿尔茨海默病的保护机制研究中发现，SIRT1转基因小鼠来源的原代神经元中，β-淀粉样蛋白含量减少，同时ROCK1的表达降低。以往的研究也发现，ROCK1能够调节α-蛋白激酶活性，与淀粉样前体蛋白的代谢有关。这说明SIRT1增强α-分泌酶介导的APP非淀粉样蛋白途径可能部分通过ROCK1通路，然而，SIRT1与ROCK1之间的调控关系以及二者在白藜芦醇对抗Aβ诱导神经元损伤中的作用并不清楚。
　　 基于以上的研究，为探讨白藜芦醇对Aβ25-35毁损神经元的保护作用，并探讨SIRT1和ROCK1在该过程中的作用机制，我们设计了本项实验:(1)选用PC12细胞作为神经元培养模型，加入不同浓度的Aβ25-35，观察Aβ25-35对PC12细胞的损伤情况;(2)在Aβ25-35毁损PC12细胞的培养基内加入不同浓度的白藜芦醇，通过MTT和LDH检测，观察白藜芦醇对Aβ25-35损伤PC12细胞的保护作用，并分析筛选出其最佳保护浓度;(3)通过Hoechst33342/PI双染、流式细胞术及细胞内钙离子浓度检测分析白藜芦醇对Aβ25-35诱导的PC12细胞凋亡情况的影响;(4)为进一步探讨探讨白藜芦醇发挥神经保护作用的分子机制，我们应用RT-PCR和Westernblot技术检测了SIRT和ROCK1在mRNA水平和蛋白水平的表达变化;(5)应用尼克酰胺（SIRT1的抑制剂）和Y-27632(ROCK1的抑制剂)处理PC12细胞，进一步明确SIRT1及ROCK1在白藜芦醇对抗Aβ25-35毁损PC12细胞中的作用及二者之间的调控关系。
　　 本实验的研究结果显示，
　　 (1)给予10μmol/L、20μmol/L和40μmol/L的Aβ25-35毁损PC12细胞，可见细胞的突起从远端开始崩解、碎裂。随着Aβ25-35浓度的升高，PC12细胞毁损逐渐加重。MTT结果显示细胞活性与Aβ25-35浓度呈负相关。在Aβ25-35的三个浓度组中，20μmol/L浓度伤易于观察与检测，作为后续实验中细胞损伤的选用浓度。在Aβ25-35毁损前2h，给予12.5μmol/L、25μmol/L、50μmol/L及100μmol/L四个浓度的白藜芦醇预孵育PC12细胞，经细胞生长观察及MTT、LDH细胞活性分析，各浓度组均呈现明显的保护作用（P＜0.01），其中50μmol/L白藜芦醇保护组的保护作用强于其他浓度组(P＜0.01），选为研究白藜芦醇保护作用的使用浓度。
　　 (2)Hoechst33342/PI双染结果显示，白藜芦醇保护组的细胞凋亡率明显低于Aβ25-35损伤组(P＜0.01);流式细胞术检测结果显示，白藜芦醇能够有效地同时抑制Aβ25-35诱导的早期凋亡和晚期凋亡(P＜0.01);细胞内钙离子浓度检测结果显示，Aβ25-35损伤组细胞钙离子荧光强度较空白对照组明显增强，钙离子浓度显著升高，给予白藜芦醇保护以后，钙离子荧光强度较Aβ25-35损伤组明显减弱(P＜0.01)。
　　 (3)RT-PCR和Westernblot的结果均显示，Aβ25-35抑制SIRT1的表达，同时增强ROCK1的表达（P＜0.01），给予白藜芦醇后，可明显增加PC12细胞SIRT1表达，降低ROCK1表达（P＜0.01）。为进一步明确SIRT1及ROCK1的作用及调控关系，本实验应用了SIRT1的抑制剂尼克酰胺和ROCK1的抑制剂Y-27632，结果显示，尼克酰胺显著地抑制SIRT1的表达并激活ROCK1的表达(P＜0.01);Y-27632明显抑制ROCK1的表达（P＜0.01），而对SIRT1的表达几乎没有影响。以上数据说明，ROCK1是SIRT1下游的一个信号分子，并且受SIRT1的负调控。
　　 本项研究表明，白藜芦醇通过激活SIRT1进而抑制其下游信号分子ROCK1，对抗β-淀粉样蛋白诱导的PC12细胞凋亡，发挥神经保护作用。SIRT1-ROCK1信号通路在阿尔茨海默病的病理机制中起着重要的作用。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

实验材料

一、细胞系

二、主要仪器设备

三、实验试剂及耗材

四、主要溶液配制

实验方法

一．Aβ25-35损伤PC12细胞模型的建立

二．白藜芦醇对Aβ25-35损伤PC12细胞的保护作用

三．MTT法检测细胞活性

四．LDH活性测定

五．实验分组

六．Hoechst 33342／PI双染检测细胞凋亡情况

七．流式细胞术分析细胞凋亡

八．细胞内钙离子浓度的检测

九．RT-PCR检测SIRT1、ROCK1 mRNA的表达变化

十．Western blot检测SIRT1、ROCK1蛋白的表达

十一． 尼克酰胺(SIRT1抑制剂)对白藜芦醇神经保护作用的影响

十二．尼克酰胺(SIRT1抑制剂)和Y-27632(ROCK1抑制剂)对SIRT1和ROCK1表达的影响

十三．统计学处理

实验结果

一．Aβ25-35损伤PC12细胞模型的建立

二．白藜芦醇对Aβ25-35损伤细胞的保护作用

三．细胞活性分析结果

四．Hoechst 33342／PI双染检测细胞凋亡结果

五．流式细胞术定量分析细胞凋亡结果

六、细胞内钙离子检测结果

七．白藜芦醇能够激活SIRT1的表达同时抑制ROCK1的表达

八．尼克酰胺(SIRT1抑制剂)减弱白藜芦醇的神经保护作用

九．SIRT1下调ROCK1的表达

讨论

结论

图表

参考文献

致谢

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