Fucoidan对β淀粉样蛋白和d-gal联合诱导PC12细胞和小鼠学习记忆能力损伤的保护作用

摘要

目的:
　　阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一种进行性神经退行性疾病，临床表现为记忆和其他认知功能的丧失。现代医学研究表明，AD发病主要与β-淀粉样肽25～35(Aβ25～35)在脑组织异常沉积、脑内神经血管单元功能异常导致Aβ25～35清除障碍、胆碱能神经元受损、氧化应激、神经炎症反应或基因突变等因素有关。Fucoidan是富含岩藻糖和硫酸酯基的水溶性杂聚糖，目前发现仅存在于褐藻和某些棘皮动物，如海参、海胆体内，而褐藻来源的Fucoidan具有独特的分支结构，并且不同种属具有不同比例的半乳糖、木糖、甘露糖和糖醛酸等。Fucoidan具有抗衰老、抗凝血、抗血栓、免疫调节、抗肿瘤等活性，是重要的海洋药源物质。
　　本实验研究Fucoidan对Aβ25～35和D-gal联合应用致PC-12细胞损伤的保护作用，检测与衰老相关的生化指标和与细胞凋亡相关的蛋白的变化;采用D-gal用药诱导建立衰老小鼠模型，研究Fucoidan对衰老小鼠学习记忆的改善作用和机制。
　　方法:
　　1.采用乙醇分级沉淀法从粗品Fucoidan中纯化获得Fucoidan。
　　2.采用苯酚-硫酸法、硫酸-咔唑法、自动指示旋光仪、核磁共振仪分别测定Fucoidan的总糖含量、糖醛酸含量、旋光度和官能团。
　　3.凝聚态Aβ25～35和D-gal的制备，采用酶学检测、Westem blot、流式细胞术得到最佳药物浓度为25μM&10mM。
　　4.MTT检测Fucoidan细胞毒性作用。
　　5.光学显微镜和Hoechst33258染色观察观察细胞的外部形态和凋亡细胞核形态。
　　6.流式细胞术检测Fucoidan对细胞的影响。
　　7.采用Western blot方法检测细胞中caspase3、caspase3/17p、caspase8、caspa7e9、CytC和Livin、XIAP在蛋白水平以及酶学方法检测细胞中SOD活力和GSH的含量。
　　8.建立D-gal衰老模型，动物行为学实验，酶学检测组织中SOD和AChE的活力，GSH和ChAT含量，尼氏染色检测尼氏小体数量。
　　结果:
　　1.Fucoidan的得率为38.91％。
　　2.Fucoidan总糖含量、硫酸基团含量、糖醛酸含量、分子量和旋光度分别为44.7％、18.5％、12.5％、26.61×104Da和0.99°(20℃)
　　3.随着药物浓度的升高，细胞的存活率下降，与Control组相比，Aβ&D-gal(15μM&10mM、20μM&10mM、25μM&10mM、30μM&10mM)在处理36h、48h、72h后细胞的存活率下降。酶学检测、Western blot、流式细胞术得到药物浓度为10mM&25μM，处理时间为48h诱导效果最佳。
　　4.Fucoidan处理细胞24h后，各组细胞和用药组细胞相比，细胞的存活率没有显著性差异，说明Fucoidan没有明显的细胞毒性作用。
　　5.Fucoidan保护细胞24h后，Fucoidan各组与对照组相比，细胞神经丝的长度有所恢复，细胞密度增大。PC12细胞逐步呈现弥漫均匀的低荧光强度，出现了正常细胞的特征，说明Fucoidan能够有效的减少细胞凋亡，使凋亡细胞显著减少。流式细胞实验结果显示，细胞的存活率明显下降。
　　6.Fucoidan处理细胞24h后，Fucoidan各组与对照组相比，细胞早期凋亡和晚期凋亡的数量比明显下降。
　　7.Fucoidan保护细胞24h后，200μg/mL，400μg/mL组的caspase3、caspase8、caspase9、CytC的表达量明显下降，Livin、XIAP的表达量明显上升。Fucoidan各组细胞的SOD的活力和GSH的含量显著提高。
　　8.水迷宫结果显示，用药组Fucoidan100mg/kg和200mg/kg组与模型组相比，小鼠找到平台的潜伏期明显缩短。脑组织中GSH，Ach的含量，ChAT的活性上升，AChE活性下降。血清中SOD活力和GSH含量增加，Fucoidan能够提高抗氧化防御酶的活性。
　　结论:
　　Fucoidan对衰老的小鼠的学习记忆能力有改善作用，通过水迷宫、酶学检测相关衰老的指标，Fucoidan是通过调节神经因子的表达来改善小鼠的学习和记忆能力。细胞实验证明，Fucoidan能够抑制与细胞凋亡相关的蛋白表达，促进凋亡抑制因子的表达从而对细胞有保护作用。

目录

声明

摘要

前言

材料与方法

实验材料

实验方法

结果

1．Fucoidan的理化性质

2．不同浓度Aβ25～35和D-gal对PC-12细胞的损伤

3．Fucoidan对PC-12细胞的保护作用

4．Fucoidan对D-gal所致衰老小鼠学习记忆和理化指标的改善作用

讨论

结论

参考文献

综述 阿尔茨海默症治疗的研究进展

附录

攻读学位期间发表论文情况

致谢